ATCC細胞將對數生長期的 MC3T3-E1細胞以1×106 /皿接種于35 mm細胞培養皿(Nunc)中, 用*培養基(α-MEM基本培養基添加 10% FBS), 在37 °C、5% CO2培養箱中培養24 h后, 更換為成骨分化培養基(α-MEM基本培養基, 添加 10% FBS、50 μg/mL抗壞血酸和10 mmol/L β-甘油磷酸鈉)誘導細胞成骨分化(0 d), 并分別在誘導分化 4 d(分化中期)或7 d(礦化起始期)時, 將細胞分為4組: 即對照組(C)、μ g組、1 g組和2 g組, 繼續培養12 h后, 收集細胞樣品用于后續檢測。

 對硝基苯磷酸(p-nitrophenyl phosphate, pNPP) 法檢測堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性

MC3T3-E1經誘導成骨分化4 d或7 d后, 分別在對照、μ g、1 g和2 g環境下繼續培養12 h后, 采用pNPP法檢測細胞內的ALP活性。從不同環境中取出細胞, 去掉培養基, 經PBS清洗后, 向每皿中加入1 mL 0.5% Triton X-100, 放入–80 °C, 反復凍融3次后, 將細胞裂解液吸入1.5 mL Eppendorf管中, 15 000 g, 4 °C離心5 min, 吸取上清, 采用Alkaline Phosphatase Yellow (pNPP) Liquid Substrate System for ELISA檢測細胞內ALP活性, 分別在反應0 min 與10 min時在405 nm讀數, 以10 min讀數減去0 min 讀數來分析ALP活性, 同時, 采用BCA法檢測蛋白濃度。ALP活性以蛋白含量做歸一化處理后以對照組為參照用百分比表示。

茜素紅S染色檢測礦化結節

 MC3T3-E1經誘導成骨分化7 d后, 分別在4種不同環境下繼續培養12 h后, 從不同環境中取出細胞, 去掉培養基, 經 PBS清洗后, 向每皿中加入2 mL 10%中性甲醛, 固定細胞15 min, PBS清洗, ATCC細胞每皿加入1 mL 0.5%茜素紅S染色15 min, 用自來水在搖床上搖動清洗4次, 每次5 min。采用掃描儀對著色的礦化結節進行掃描, 并采用Image J軟件(National Institutes of Health, NIH)對礦化結節面積進行分析。
 PTP-1B蛋白IgG     磷酸化活化復制因子2    小鼠少突膠質髓鞘糖蛋白(OMgp-Ab) 
 P-鈣粘附分子IgG     磷酸化活化復制因子2    小鼠少突膠質髓鞘糖蛋白(OMgp-Ab) 
 P物質IgG     活化轉錄因子3    小鼠上皮中性粒活化肽78(ENA-78/CXCL5)
 P物質受體IgG     自噬相關蛋白1    小鼠色素上皮衍生因子(PEDF)
 P選擇素IgG     磷酸化自噬相關蛋白1    小鼠色素C(Cyt-C)
 Rad51IgG     自噬相關蛋白7    小鼠三碘甲狀腺原氨酸(T3)
 Raf激酶抑制蛋白IgG     G1氨基丁酸A型受體相似蛋白2    小鼠乳鐵傳遞蛋白/乳鐵蛋白(LF/LTF)
ATCC細胞