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上海莼試生物技術(shù)有限公司
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ATCC細(xì)胞
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原代細(xì)胞增殖檢測(cè):3H同位素滲入法實(shí)例

時(shí)間:2018/6/26閱讀:227
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一、原理

原代細(xì)胞在有絲分裂原PHA、ConA 等的刺激下,產(chǎn)生增殖反應(yīng),DNA和RNA合成明顯增加,如在培養(yǎng)液中加入3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR),則可被轉(zhuǎn)化中的細(xì)胞攝入。測(cè)定標(biāo)記淋巴細(xì)胞的放射強(qiáng)度可反映淋巴細(xì)胞增殖的程度。

二、儀器和材料

RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液、小牛血清、2-巰基乙醇(2-ME)、青霉素、鏈霉素、刀豆蛋白A(ConA)、Hank's液、PBS緩沖液(pH7.2-7.4)、3H-TdR、閃爍液[2,5-二苯基惡唑(PPO)0.5g、1,4-雙-(5-苯基惡唑基)-苯(POPOP)0.25g、二甲苯500mL混勻]

200目篩網(wǎng),96孔培養(yǎng)板(平底),手術(shù)器械、二氧化碳培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、液體閃爍儀、多頭細(xì)胞取集器、49型玻璃纖維濾紙。

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1、脾細(xì)胞懸液制備

無(wú)菌取脾,置于盛有適量無(wú)菌Hank's液的小平皿中,用鑷子輕輕將脾撕碎,制成單細(xì)胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾,用Hank's液洗3次,每次離心10min(1000r/min)。然后將細(xì)胞懸浮于2mL的*培養(yǎng)液中,用臺(tái)酚蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)(應(yīng)在95%以上),Z后用RPMI1640*培養(yǎng)液將細(xì)胞數(shù)調(diào)成5×106個(gè)/mL。

2、淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)

將脾細(xì)胞懸液加入到96孔培養(yǎng)板中,200μL/孔,每一份脾細(xì)胞懸液分裝6個(gè)孔,3孔加ConA(5ug/mL),另3個(gè)孔不加ConA 作為對(duì)照。置5% CO2,37℃培養(yǎng)72h,培養(yǎng)結(jié)束前6h,每孔加入3H-TdR 20μL,使其終濃度為(3.7-18.5)×104Bq/mL。用多頭細(xì)胞收集器將細(xì)胞取集于玻璃纖維濾紙上。濾紙片充分干燥后置測(cè)量瓶中,加入7mL閃爍液,用液閃儀測(cè)定每分鐘脈沖數(shù)(cpm)。

3、數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定

一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),方差齊,計(jì)算F值,F(xiàn)值< F0.05,結(jié)論:各組均數(shù)間差異無(wú)顯著性;F值≥F0.05,P≤0.05,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì);對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì);若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

原代細(xì)胞以每分鐘脈沖數(shù)(cpm)表示增殖程度,用刺激指數(shù)(SI)來(lái)表示

                           實(shí)驗(yàn)孔cpm
                   SI=  ─────────
                                 對(duì)照孔cpm

受試樣品組的SI值顯著高于對(duì)照組的SI值,即可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。

TLC法鑒別 鬧洋花 中藥對(duì)照藥材 121174-200502 2.0g

TLC法鑒別 葛根(甘葛藤) 中藥對(duì)照藥材 121175-200503 1.0g

TLC法鑒別 爵床 中藥對(duì)照藥材 121176-200502 5.0g

TLC法鑒別 板蘭根(菘藍(lán)) 中藥對(duì)照藥材 121177-200503 1.0g

TLC法鑒別 甜瓜蒂 中藥對(duì)照藥材 121178-200001 1.0g

TLC法鑒別 蜘蛛香 中藥對(duì)照藥材 121179-200001 1.0g

TLC法鑒別 地黃(生地黃) 中藥對(duì)照藥材 121180-200402 5.0g

TLC法鑒別 紅杜仲 中藥對(duì)照藥材 121181-200001 2.0g

TLC法鑒別 升麻 中藥對(duì)照藥材 121182-200502 0.5g

TLC法鑒別 白花蛇舌草 中藥對(duì)照藥材 121183-200402 1.0g
原代細(xì)胞

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