2017年發(fā)表在Nature上的“Reversing SKI–SMAD4-mediated suppression is essential for TH17 cell differentiation”的文章揭示了TGFβ的“反向調(diào)控”策略：正常情況下，SMAD4蛋白與抑制因子SKI形成復(fù)合物，像“基因剎車”一樣抑制TH17核心轉(zhuǎn)錄因子RORγt的表達(dá)；而TGFβ通過(guò)誘導(dǎo)SKI降解，解除這一抑制，最終激活TH17分化程序。更重要的是，研究發(fā)現(xiàn)的SKI-SMAD4 信號(hào)軸，為靶向調(diào)控TH17細(xì)胞提供了全新治療靶點(diǎn)。該研究通過(guò)ChIP-seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)SMAD4并非廣泛抑制TH17相關(guān)基因，而是特異性結(jié)合RORγt基因（Rorc）的啟動(dòng)子區(qū)域，直接抑制其轉(zhuǎn)錄。

研究背景

TH17細(xì)胞在宿主防御、炎癥和自身免疫中至關(guān)重要，TGFβ與IL-6協(xié)同對(duì)TH17細(xì)胞分化起重要作用，但TGFβ促進(jìn)TH17細(xì)胞分化的機(jī)制尚不清楚。

技術(shù)路線

研究結(jié)果

本研究首先通過(guò)體外分化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SMAD4缺失的T細(xì)胞在僅含IL-6、無(wú)TGFβ信號(hào)時(shí)，仍能高效分化為TH17細(xì)胞，而野生型T細(xì)胞無(wú)法分化；雙敲除小鼠（同時(shí)缺失SMAD4和TGFβRII）的T細(xì)胞在IL-6單刺激下，TH17相關(guān)基因（Rorc、Il17a、Il23r等）表達(dá)顯著上調(diào)，與SMAD4缺失的T細(xì)胞結(jié)果一致。進(jìn)而又進(jìn)行了體內(nèi)功能驗(yàn)證，結(jié)果顯示雙敲除小鼠脾臟和淋巴結(jié)中TH17細(xì)胞比例與野生型相當(dāng)，而單純TGFβRII敲除小鼠幾乎無(wú)TH17細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）模型中，雙敲除的T細(xì)胞分化為致病性TH17細(xì)胞的能力與野生型一致，且小鼠表現(xiàn)出類似的病理?yè)p傷。誘導(dǎo)型SMAD4缺失實(shí)驗(yàn)顯示，急性缺失 SMAD4可在無(wú)TGFβ受體信號(hào)時(shí)促進(jìn)TH17分化，證實(shí)SMAD4是抑制TH17分化的關(guān)鍵分子。以上結(jié)果表明SMAD4缺失解除TGFβ信號(hào)依賴的TH17細(xì)胞分化抑制。

圖1. SMAD4缺失導(dǎo)致在缺乏TGFβ信號(hào)的情況下TH17細(xì)胞分化。

圖S1. 在沒(méi)有SMAD4的情況下TH17細(xì)胞分化。

接下來(lái)作者對(duì)SMAD4缺失如何影響控制TH 17細(xì)胞分化的分子機(jī)制進(jìn)行了研究。利用RNA-seq檢測(cè)基因表達(dá)差異，結(jié)果顯示SMAD4缺失的T細(xì)胞激活后12h內(nèi)，Rorc表達(dá)顯著升高，早于其他TH17相關(guān)基因（如Il17a、Batf），且RORγt蛋白水平同步上調(diào)?；匮a(bǔ)SMAD4可抑制SMAD4缺失的T細(xì)胞Rorc表達(dá)及 TH17分化，而異位表達(dá)RORγt可逆轉(zhuǎn)SMAD4的抑制作用，證實(shí)了RORγt是SMAD4的關(guān)鍵下游靶點(diǎn)。并通過(guò)ChIP-seq 進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示SMAD4直接結(jié)合Rorc基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域，但不結(jié)合Il17a/Il17f。以上結(jié)果表明SMAD4 通過(guò)直接抑制RORγt調(diào)控TH17分化。

圖2. SMAD4通過(guò)直接抑制Rorc表達(dá)來(lái)控制TH17細(xì)胞程序。

圖S2. SMAD4抑制RORγt表達(dá)。

以上研究中發(fā)現(xiàn)無(wú)論是否存在TGFβ，SMAD4仍然與Rorc位點(diǎn)結(jié)合，作者提出TGFβ信號(hào)通路改變了SMAD4與其他蛋白質(zhì)的相互作用的假設(shè)。通過(guò)IP-MS和Co-IP發(fā)現(xiàn)，SMAD4與轉(zhuǎn)錄抑制因子SKI結(jié)合，且TGFβ刺激可顯著降低SKI蛋白水平，破壞SKI-SMAD4復(fù)合物；SMAD4突變體（無(wú)法結(jié)合SKI）失去對(duì)TH17分化的抑制能力，證實(shí)了SKI-SMAD4互作是抑制RORγt的關(guān)鍵。接著對(duì)SKI的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)SKI過(guò)表達(dá)可抑制Rorc啟動(dòng)子區(qū)H3K9乙酰化，而SMAD4缺失可逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)，表明SKI-SMAD4復(fù)合物通過(guò)調(diào)控染色質(zhì)修飾抑制基因表達(dá)。經(jīng)TGFβ處理的野生型T細(xì)胞，Rorc啟動(dòng)子H3K9乙酰化水平升高，而SMAD4缺失的T細(xì)胞在無(wú)TGFβ時(shí)仍維持高乙?；M(jìn)一步證明了TGFβ通過(guò)降解SKI解除去乙酰化抑制。以上結(jié)果表明，TGFβ通過(guò)降解SKI解除SMAD4介導(dǎo)的抑制。

圖3. TGFβ信號(hào)破壞SKI-SMAD4復(fù)合物，以促進(jìn)TH17細(xì)胞分化。

S3. 低劑量TGFβ下SKI的鑒定及其降解。

最后作者對(duì)SKI-SMAD4軸的功能進(jìn)行了驗(yàn)證。異位表達(dá)SKI可顯著抑制野生型T細(xì)胞的TH17 分化和Rorc表達(dá)，且該抑制作用依賴SMAD4；干擾SKI表達(dá)可使野生型T細(xì)胞在無(wú)TGFβ時(shí)分化為TH17細(xì)胞，證明了SKI是TH17分化的負(fù)調(diào)控因子。體內(nèi)致病性結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)SKI的T細(xì)胞在EAE模型中分化為TH17細(xì)胞的能力顯著受損，而SKI缺陷細(xì)胞分化增強(qiáng)，表明SKI-SMAD4 軸在體內(nèi)調(diào)控TH17細(xì)胞的致病性分化。

圖4. SKI以SMAD4依賴的方式抑制TH17細(xì)胞分化。

圖S4. SKI和SMAD4協(xié)同抑制TH17細(xì)胞分化。

圖S5. TGFβ超家族信號(hào)克服了激活T細(xì)胞中SKI-SMAD4復(fù)合物介導(dǎo)的RORγt表達(dá)抑制，以促進(jìn)TH17細(xì)胞分化。

本研究通過(guò)基因敲除、分子互作、表觀遺傳及體內(nèi)外功能實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)性闡明了TGFβ-SKI-SMAD4-RORγt通路在TH17細(xì)胞分化中的關(guān)鍵機(jī)制，為靶向SKI-SMAD4軸治療TH17相關(guān)疾?。ㄈ缱陨砻庖卟。┨峁├碚撘罁?jù)。