實時熒光定量PCR技術實驗操作步驟：

1、RNA提?。?/p>

　　針對莖環狀結構RT引物，RNA正常提取就好;對于Oligod(T)特異的RT引物，盡量用特殊試劑盒提取miRNA。

2、反轉錄：

　　反轉錄過程對酶沒有特殊要求，操作按照反轉錄酶的說明書進行。對于引物，在反轉錄過程中只需加入Oligod(T)特異的RT引物或莖環狀結構RT引物，不需要另外添加其他RT引物。用Oligod(T)特異的RT引物時，RNA需要進行3'Poly(A)加尾處理。

　　內參基因不需要單獨設計RT引物，可以用熒光定量PCR的反向引物作為RT引物。

3、熒光定量PCR：

　　先優化PCR體系(引物濃度、退火溫度等)，進行引物測試，確保擴增曲線正常且溶解曲線為單一的尖峰，陰性對照無擴增，則引物測試合格，再進行后續實驗(常規操作)。