技術簡介

MADS轉錄因子的同源蛋白SEPALLATA3 (SEP3)和AGAMOUS (AG)是調控擬南芥花發育分化的重要DNA結合蛋白。在雌蕊發育階段，SEP3和AG形成異源四聚體，通過識別CArG-box序列來調控基因的表達。Seq-DAP-seq技術與ChIP-seq聯合使用，可用于分析轉錄因子的DNA結合域與基因組的互作。

文獻速遞

2020年發表在Nucleic Acids Research上的“Genome-wide binding of SEPALLATA3 and AGAMOUS complexes determined by sequential DNA-affinity purification sequencing”文章，發現MADS-TFs多聚化類型影響DNA結合域蛋白的全基因組結合模式和靶基因的表達。文章開發了一種seq-DAP-seq技術用于轉錄因子與全基因組的互作研究，并結合RNA-seq技術檢測靶基因表達。

研究首先構建了三種質粒分別表達三種多聚體蛋白，分別為SEP3同源二聚體（純化標簽為3×FLAG）、SEP3-AG異源四聚體（純化標簽為3×FLAG和5×MyC）和SEP3^Δtet-AG異源二聚體（純化標簽為3×FLAG和5×MyC）。使用多標簽順序純化的方式分離異源多聚體蛋白（Figure 1. A）。這種方法可篩選出MADS復合體用于DNA親和純化測序。所有DAP-seq和seq-DAP-seq實驗均使用擬南芥Col-0基因組DNA文庫進行。研究通過統計SEP3、SEP3^Δtet-AG和SEP3-AG的共有峰和特定峰來分析他們的全基因組結合位點（Figure 1. C-F）。對轉錄因子結合位點（TFBS）進行建模，發現這些不同的復合物具有高度相似的CArG-box序列（Figure 2）。

Figure 1. Seq-DAP-seq workflow and data analysis.

Figure 2. Modeling of TF binding sites.

研究比較了SEP3-AG異源四聚體和SEP3^Δtet-AG異源二聚體的seq-DAP-seq數據，結果表明與SEP3^Δtet-AG相比，SEP3-AG具有更高的DNA結合親和力和豐富的CArG-box結合空間位置（Figure 4. A-B）。為了驗證這一結果，研究使用KNUCKLES (KNU)啟動子生成了不同間距DNA片段的KNU啟動子CArG-box結合位點進行EMSAs檢測分析。結果表明，四聚化不僅允許獲得不同的結合模式，而且與具有強間隔偏好的雙位點結合，而二聚體優先結合單個高親和力位點，但不能與較低親和力的二級位點相互作用。

Figure 4. Analysis of intersite spacing for SEP3-AG, SEP3 and SEP3^Δtet-AG.

研究比較了Seq-DAP-seq（體外）與ChIP-seq（體內）檢測中的AG、SEP3或前兩者都包含的結合區域，發現seq-DAP-seq和ChIP-seq結合區域相關的基因之間有顯著的重疊（Figure 5. A-C），進而確定了受調控的靶點。研究通過比較突變體花序分生組織RNA-seq數據，獲得了受SEP3調控的基因。研究發現SEP3-AG靶標的seq-DAP-seq和ChIP-seq具有高度重疊，與AG和/或SEP3相比差異表達基因（DEGs）比例顯著，表明能夠通過seq-DAP-seq識別那些在體內被SEP3-AG復合物結合和調控的轉錄因子結合位點。研究還發現了僅在seq-DAP-seq中而不在ChIP-seq中的結合位點，表明他們是SEP3-AG復合物的新靶點。

Figure 5. Venn diagrams for seq-DAP-seq, ChIP-seq and RNA-seq datasets.

小結

seq-DAP-seq具有純化轉錄因子（TF）復合物和直接定位于基因組DNA的優勢，可確定特定TF復合物（SEP3-AG異源四聚體）的潛在全基因組結合位點。seq-DAP-seq和RNA-seq數據的組合，能夠鑒定出ChIP-seq實驗中可能不存在的已知和潛在的新直接靶標。與ChIP-seq相比，seq-DAP-seq可以在單堿基水平上檢測基因組結合位點的位點間距，從而提高TF-DNA互作檢測的準確性。