免疫熒光（immunofluorescence）是一種常用的光學(xué)顯微術(shù)，即用熒光顯微鏡來(lái)觀察細(xì)胞中的特定生物分子。免疫熒光依賴于抗體抗原的特異性結(jié)合，然后通過(guò)直接標(biāo)記或間接標(biāo)記方法使用熒光分子指征抗體-抗原結(jié)合的位置，以確定目標(biāo)生物分子在細(xì)胞中的位置、豐度和分布情況。那免疫熒光實(shí)驗(yàn)流程是怎樣的呢？一起來(lái)學(xué)習(xí)一下吧！

1. 固定

固定液種類：有機(jī)溶劑（甲醇、乙醇、丙酮等）；交聯(lián)劑（4%PFA、10%中性福爾馬林），固定液的選擇取決于被研究抗原的性質(zhì)及所用抗體的特性。但針對(duì)磷酸化的抗體，不適合用甲醛，會(huì)導(dǎo)致磷酸蛋白從膜表面轉(zhuǎn)移到胞漿中，故應(yīng)選擇冰冷的無(wú)水甲醇或無(wú)水乙醇，同時(shí)應(yīng)注意甲醛會(huì)揮發(fā)，在4-8°C不宜儲(chǔ)存太久。

固定時(shí)間：取決于組合塊的大小和類型，對(duì)于大多數(shù)組織，18-24h較為理想，細(xì)胞固定時(shí)間較短，一般2%的甲醛室溫固定20min即可。

2. 透化

通透的目的是使抗體進(jìn)入胞內(nèi)。0.5% Triton X-100 室溫通透20 min（針對(duì)胞內(nèi)抗原，若是細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原則省略該步驟）；除了Triton X-100，丙酮也可作為通透劑，并且丙酮固定后的樣品不需要通透。

3. 封閉

封閉可減少一抗和二抗與非特異性位點(diǎn)結(jié)合。通透后用PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清，室溫封閉30min。常用的封閉液包括：與二抗同一來(lái)源的血清、BSA或者是羊血清。從封閉開(kāi)始所有的步驟，一定要注意樣品的保濕，避免樣品的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。醛類固定的樣品，在用一抗孵育前用含0.3M gan氨酸的封閉液進(jìn)行封閉。

4. 一抗孵育

根據(jù)一抗說(shuō)明書(shū)，按照適當(dāng)比例用一抗稀釋液稀釋一抗，用吸水紙吸盡封閉液，每張玻片滴加稀釋好的一抗并放入濕盒， 4℃孵育過(guò)夜。回收一抗，加入PBST， 在搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5 min，共洗滌3次。

5. 熒光二抗孵育

用吸水紙吸盡洗滌液后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中孵育1h后，回收二抗，接著用PBST洗3次，每次5 min；由于熒光容易淬滅，故從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都要避光。 

6. 復(fù)染核（定位的關(guān)鍵）

在玻片上滴加DAPI，并注意避光孵育5min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，然后用PBST洗3次，每次5min，洗去多余的DAPI。

7. 封片

用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察。

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