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酶標記抗體法的染色步驟

來源:上海百蕊生物科技有限公司   2011年12月16日 14:51  

 (一)直接法
(1)石蠟切片脫蠟至水,冰凍切片或細胞涂片經丙酮固定10min,PBS洗3min×2次。
(2)滴加0.3%Hz02甲醇液,室溫處理20min,PBS洗3min× 3次(抑制內源性過氧化物酶活性)。
(3)0。l%*37~C消化20min或AR(只限于石蠟片),PBS洗3min×3次。
(4)滴加1:(5~20)正常羊血清或牛血清20min(室溫或37℃),吸去多余血清,不洗。
(5)適當稀釋的酶標記特異性抗體(一抗)孵育60min 37℃,PBS洗3min×3次。
(6)0.04%DAB+0.03%Hz02顯色8—12rain,在光鏡下控制。
(?)充分水洗,蘇木精復染,鹽酸乙醇分化15~30s。
(8)常規樹膠封片,結果觀察。

(二)間接法
(1)~(3)同直接法。
(4)第二抗體的正常動物血清1:20,室溫20min(阻斷非特異性結合位點),傾去多余血清,不洗。
(5)適當稀釋的特異性抗體(一抗)濕盒37℃中孵育60min,或室溫孵育4h,或4℃孵育過夜,PBS洗3min×3次。
(6)酶標記抗體(二抗)37℃孵育40min,PBS洗3rain×3次
(7)DAB/Hz02顯色8~12rain,鏡下控制。
(8)以下同直接法。

(三)三步酶標間接法
三步酶標間接法是在酶標間接法的基礎上再加一步酶標記三抗,信號進一步放大,使敏感性進一步增加。第三步酶標記三抗必須是抗第二步酶標記二抗,例如第三步酶標記二抗是兔抗鼠,第三步酶標記三抗應該是羊抗兔酶標抗體。另外,第二步和第三步酶標抗體所用的酶必須是同一種酶。

(四)酶標記抗原法
該方法僅用一種特異性抗體,抗體必須過量。其原理是抗體中二個抗原結合位點(二價)分別與組織細胞內的抗原和酶標記抗原結合,原理見圖4—6。該法的zui大的優點是對抗體的特異性和純度要求不高,可以非常穩定地進行IHC的雙重標記,標記二種抗原。

 

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