研究背景

       心肌細胞（CMs）是心臟的肌肉細胞，通過跳動產生機械張力來維持心臟功能。CMs的機械輸出來源于沿肌纖維排列的肌節的縮短。人iPS可以分化為跳動的CMs（hiPSC-CMs），但hiPSC-CMs中肌原纖維紊亂，不像原代CMs中那樣排列整齊，這種混亂一直是應用hiPSC-CMs進行體外心功能分析的限制因素。基質微圖案化培養hiPSC-CMs可以成功誘導胞內肌原纖維對齊，從而增強收縮機制的成熟度，并可將這些工程細胞作為心臟收縮力的模型。在已知機械性能的柔性基質上微圖案化培養hiPSC-CMs，通過wuchuang和微創顯微法可計算機械輸出（圖1A）。此外通過明視野顯微鏡獲得的搏動細胞影像，也可跟蹤細胞運動，使用可變形微柱做基質可測量細胞力。還有研究用構建的包括hiPSC-CMs或與其他細胞共培養在內的多細胞系統對機械輸出進行了研究。誘導胞內肌原纖維排列是加速hiPSC-CMs收縮成熟的關鍵，而肌原纖維在單細胞系統中更容易成像，可實現活細胞分析。

       本文所述的平臺整合了不同成像類方法來分析微圖案化hiPSC-CMs的機械輸出，得到了表征細胞機械輸出的一系列參數。還利用該多重成像組合方法測量了肌節長度，量化了收縮缺陷細胞中收縮運動的不同步性。檢測了藥物對hiPSC-CMs和MYBPC3基因導致收縮缺陷的細胞的機械輸出的影響。證明該方法能夠分析藥理學條件下或心臟病模型中的心臟收縮情況。

測定原理

       在每一次搏動中，心肌細胞（CMs）通過收縮機制產生心臟功能所需的機械輸出，收縮機制包括肌節沿肌原纖維縮短。人誘導多能干細胞（hiPSCs）可分化為CMs（hiPSC-CMs），通過微圖案化形成生理形狀可作為模型，穩定地模擬心臟收縮機械輸出。量化這些細胞的機械輸出可實現在培養皿中分析心臟活動。

測定參數

       研究使用了Plexithermo HCell系列單心肌細胞功能檢測系統。ZeissAxiovert 200M倒置顯微鏡，搭載Zeiss Axiocam MRm CCD相機獲取視頻，分析細胞收縮周期的機械輸出（圖1A）。獲得三類視頻：明場視頻、基質中熒光微珠的視頻、熒光肌原纖維視頻，顯示了基質、細胞表面和肌原纖維的運動。量化每幀移動結構（細胞、微珠和肌原纖維）的平均位移（d）和移動速度（V）。使用牽引力顯微鏡通過基質的位移估算收縮力，計算了由牽引應力產生的力向量（F）的大小。F求和（ΣF），乘以V得到功率（P）。根基這些特征（d, V, ΣF, P）繪制的曲線確定參數，采用互相關算法Ncorr20以時間計算d和V（圖1B-F）。通過細胞邊界確定感興趣區域（ROI），根據ROI確定成比例的橢圓范圍，測量其中微珠的運動，得到其d曲線（圖1F）和V曲線（圖1G）。計算每幀的∑F，得到F曲線（圖1H）。利用時間繪制P（圖1I），量化肌原纖維運動（圖1J）來確定d曲線（圖1K）和V曲線（圖1L）。由d曲線得到細胞搏動率（br）。由d曲線和F曲線的峰值得到峰位移（dmax）和峰值力（ΣFmax）。通過V曲線確定收縮（VC）和舒張（VR）的峰值速度。通過P曲線確定收縮（PC）和舒張（PR）的峰值功率。時間參數（t-）表示收縮和舒張峰值間的時間（圖2A）。通過肌原纖維視頻量化sl。胞外添加kafeiyin驗證以上參數的描述效果。證明圖像分析獲得的收縮和運動參數能夠可靠地描述細胞的機械輸出。

圖1 通過顯微鏡視頻獲得hiPSC-CMs的收縮機械輸出。（A）顯微鏡獲得的三種視頻。（B）根據細胞輪廓確定ROI，明場視頻互相關算法分析該區域運動。（C）收縮活動產生的細胞平均位移（d）。（D）細胞位移的平均速度（V）。（E）熒光視頻計算微珠的平均位移（d）。（F）微珠的d曲線與時間的函數。（G）微珠V曲線與時間的函數。（H）收縮力（ΣF）。（I）功率（P）。（J）肌原纖維中肌節占據的區域發生了骨骼化。（K）J中細胞肌原纖維的d曲線。（L）J中細胞的肌原纖維V曲線。

圖2 通過繪圖得到收縮周期參數。（A）通過V曲線確定代表每個收縮周期的3個動力學參數：VC為zuida收縮速度，VR為zuida舒張速度，t為兩峰值間的時間。（B）增加kafeiyin濃度微珠d曲線的變化情況。（C）增加kafeiyin濃度功率P的變化情況。

       通過異丙醇（ISO）和omecamtiv mecarbil (OM)誘導hiPSC-CMs機械輸出變化，利用以上參數描述細胞變化，驗證了參數可靠性，可用于量化不同濃度藥物引起的收縮變化（圖3，圖4）。

圖3 異丙腎上腺素（ISO）引起的機械輸出變化。（A）牽引力顯微鏡測定細胞產生的牽引應力的熱圖。（D）熒光標記肌原纖維，成像以量化肌原纖維移動。根據ISO處理前后的微珠視頻獲得F曲線（B）和P曲線（C）。根據ISO處理前后的肌原纖維視頻獲得d曲線（E）和V曲線（F）。（G）明場視頻，獲得不同濃度ISO時的d曲線（H）和V曲線（I）。

圖4 檢測omecamtiv mecarbil (OM)引起的hiPSC-CM機械輸出變化。（A）添加OM前的肌原纖維。（B）添加后10s內肌節急性收縮。（C）添加2min后肌節出現慢性損傷。通過微珠視頻獲得添加OM前及產生急慢性現過后的F曲線（D）和P曲線（E）。通過肌原纖維視頻獲得d曲線（F）和V曲線（G）。通過細胞明場視頻獲得d曲線（H）和V曲線（I）。

       此外通過肌節視頻還可量化ISO和OM引發的收縮周期中肌原纖維的肌節長度（sl）和縮短（ss）變化（圖5），以及分析收縮缺陷細胞中，胞內運動的不同步性（圖6）。證明該多成像方法可靠且靈活多用。

圖5 ISO和OM引發的肌節長度（sl）和縮短（ss）變化。通過肌節視頻測量sl和ss。（A, E）平均sl的箱型圖。（B, F）sl zuida值。（C, G）sl最小值。（D, H）sl zuida值減去sl最小值得到ss。

圖6 編碼MYBPC3基因純合子和雜合子敲除的hiPSC-CMs中，空間（αθ）或時間（αδ）不同步性的測量參數。（A）每個像素位移峰的時間減去ROI平均位移的位移峰的時間，得到每個像素i的δ。（B）明場視頻中的ROI示意。（C）ROI中像素的δ的熱圖。（D-G）缺乏兩個拷貝（-/-）或缺乏一個拷貝（+/-）hiPSC-CMs中獲得的參數。（D）αθ。（E）αδ。（F）t。

研究結論

       本文的多成像方法不僅可表征單個hiPSC-CMs的心臟功能，還可確定闡明CM功能變化的機制的收縮參數。通過異丙腎上腺素實驗，驗證了該平臺可檢測不同藥物濃度下的收縮變化，通過OM實驗證明了檢測同一藥物急性和慢性影響的必要性。此外該方法侵入性小，且對數據獲取和分析能力要求低，拓寬了應用范圍。總之，本文的多成像平臺量化了評估hiPSC-CMs收縮性能的關鍵參數。考慮到肌節和收縮運動與力產生的關聯，該平臺為測量收縮表型提供了多種角度和方法。

參考文獻：

Ribeiro,  A. J. , et al. "Multi-Imaging Method to Assay the Contractile  Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac  Myocytes." Circulation Research (2017):1572-1583.