天然存在于成體組織中的干細胞，如肌肉干細胞（MuSCs），在體內表現出強大的再生能力，而一旦培養則會迅速喪失。因此美國和瑞士研究人員P. M. Gilbert等使用生物工程基質模擬關鍵的生物物理和生物化學微環境特征，結合高度自動化的單細胞跟蹤法，證明基質彈性是培養中MuSCs命運的強力調節因子。與硬塑料（約106 kPa）上培養的MuSCs不同，在模擬肌肉彈性的軟水凝膠基質（12 kPa）上培養的MuSCs會在體外自我更新，并且進一步移植到小鼠體內后，通過wuchuang生物發光成像進行組織學和定量分析發現，MuSCs還可廣泛促進肌肉再生。再次證明通過模擬生理組織硬度，可實現成體肌肉干細胞的繁殖，對未來的細胞療法有極大啟發作用。文章以“Substrate Elasticity Regulates Skeletal Muscle Stem Cell Self-Renewal inCulture”為題發表于SCIENCE。

背景

       許多成體組織含具有明確特征及顯著再生能力的干細胞。如果干細胞在分離后立即從一個個體移植到另一個個體，這種特性將被保留，而治療應用中，一旦干細胞置于平板培養以增加其數量，這種特性就消失了。當移植到小鼠體內時，肌肉微環境（niche）使新分離的肌肉干細胞（MuSCs）能廣泛促進骨骼肌再生。而標準組織培養塑料板上生長的MuSCs則失去了“干細胞性”，獲得的祖細胞再生潛力和治療潛力都大大降低。盡管對生化信號進行了廣泛研究，但目前仍無法實現對包括MuSCs在內的培養中的功能性成體干細胞進行繁殖。已知生物物理特性如基質硬度可改變培養中細胞的分化。本研究測試了一個假設，即彈性模量在肌肉干細胞自我更新及其在肌肉再生中的功能中發揮關鍵作用。研究發現當MuSCs培養于模擬肌肉組織硬度的基質上時，可自我更新產生具有修復受損肌肉潛能的干細胞，可有助于克服成體干細胞治療應用上的一個主要障礙。與誘導多能干細胞（iPS）或必須定向分化的胚胎干細胞不同，該策略利用了具有確定特征和功能的天然組織干細胞。

結果

       為模擬肌肉硬度并將生物物理與生物化學效應分離，研究人員構建了一個可調的聚乙二醇（PEG）凝膠平臺。通過改變前體溶液中PEG的百分比，產生具有一定硬度范圍的水凝膠（圖1A和B），包括模擬成體鼠骨骼肌彈性模量（圖1A和C）。傳統上用于細胞培養的聚苯乙烯塑料板的彈性模量約3GPa，比骨骼肌硬5個數量級以上。層粘連蛋白（laminin）是天然MuSCs微環境的成分之一，與水凝膠網絡共價交聯并用作粘附配體（圖1B底部）。為確保層粘連蛋白密度及表面化學在水凝膠和塑料培養條件下保持一致，制作了聚合后不膨脹的凝膠（圖1D），并在塑料表面澆筑一薄層PEG水凝膠（≤1mm），使MuSCs能夠感知到下面塑料的硬度（圖1D）。

       將MuSCs分離并以單細胞水平分析，柔軟或堅硬的培養表面以微孔陣列圖案化（圖1E），因為即使以熒光激活細胞分選富集，干細胞群體也存在內在的異質性。使用微孔技術可實現延時獲取數百個單一干細胞，但分析由此產生的大量數據集很有難度。因此研究人員開發了高度自動化的算法，稱為Baxter算法(SOM)，它能跟蹤多個細胞分裂的譜系關系。該算法將數據分析時間減少了約90%，錯誤率僅為1%。

       通過延時采集和自動跟蹤建立由單個細胞衍生的克隆譜系歷史（圖1E）。與柔軟（99mm/h）培養基質相比，在堅硬（120mm/h）基質上的MuSC速度增加，與已有研究結論一致。此外細胞面積隨著細胞復制及其內容物的增加而增加，并在有絲分裂后回到初始細胞面積，進一步證明了分割參數的正確。

       在柔軟水凝膠基質上培養的MuSCs并不會經歷先前培養中報道的“危機”或大量死亡。

       培養1周后，軟微孔中產生克隆的細胞數量是硬微孔中的2倍。通過Baxter算法可在克隆水平上描述這種現象。在堅硬基質上，總細胞數并不會隨時間變化，因為分裂與細胞死亡相抵消；而在柔軟基質上，細胞死亡減少，總細胞數隨時間增加（圖1G）。兩種情況下細胞都不會突然死亡，細胞死亡與時間和細胞分裂數無關（圖1G）。數據證明在軟基質上培養可提高MuSC存活率。

圖1 柔韌水凝膠提升培養中MuSC的存活率并防止分化。（A）具有可調機械特性的PEG水凝膠。楊氏模量（E）與前體聚合物濃度呈線性相關；紅圈為肌肉彈性。（B）綠色刮刀上的柔韌PEG水凝膠圖像。水凝膠的共聚焦免疫熒光圖像，以將層粘連蛋白微接觸打印于水凝膠微孔底部。（C）流變儀分析脛骨前肌肌肉（n=5小鼠，共10個肌肉）。（D）不同硬度PEG水凝膠間，凝膠表面蛋白密度沒有顯著差異（E；P＞0.05），為7.6ng/cm2 ± 1.0ng/cm2（n＞4）。（E）Baxter算法分析延時視頻。有數百個含單一MuSCs微孔的水凝膠陣列延遲顯微成像3天。視頻自動加工并分析。（F）單一MuSC（黑色點）在柔軟或堅硬培養基質上的速度。圓圈表示均速 ± SD（P＜0.0001）。（G）延遲分析期間柔軟（頂部）或堅硬（底部）基質上總MuSC數的變化。死亡（X）和分裂（O）。

       基質硬度也會影響基因表達，暗示柔軟表面上的MuSC的干細胞性得到保留。在柔軟基質上培養1周的MuSCs，產生表達肌生成素（myogenin，分化的MuSCs表達的肌源性轉錄因子）的細胞，數量較培養于硬基質上的MuSCs多1/3。延時分析在MuSC最開始分裂或分裂間都沒有觀察到統計學差異，因此排除了細胞分裂差異導致基因表達差異的可能性。另外，軟硬基質間的分裂率也沒有差異。表明基質硬度對培養中的細胞的分裂率沒有影響，但可能會阻止分化并通過提高生存能力使細胞數量增加。

       為證實柔韌基質上培養的MuSCs可保持干細胞性，體內評估了MuSCs的功能。從組成性表達螢火蟲熒光素酶（Fluc）和綠色熒光蛋白（GFP）的小鼠中分離MuSCs，培養7天。收獲細胞并計數，培養的MuSCs子代移植到免疫缺陷小鼠的脛骨前肌（TA），該小鼠經18Gy腿部照射去除了內源MuSCs。通過wuchuang體內生物發光成像（BLI）與細胞數相關的熒光素酶活性，定量分析供體細胞隨時間的行為（圖2A）。將組織學檢測到供體源肌纖維對應的生物發光值設置為植入閾值。這種體內功能分析對驗證培養的MuSCs的干細胞性至關重要。

       體內功能分析表明，培養于與肌肉組織生理模量想匹配的基質上的MuSCs可zuiyouxiao保持干細胞性。與之前的報告一致，塑料上培養的MuSCs植入顯著減少（圖2B）。移植了培養于最柔軟水凝膠上MuSCs的小鼠，生物發光信號zuiqiang，而移植了培養于最堅硬基質上MuSCs的小鼠，植入程度和植入率都降低（圖2B）。與組織培養塑料相比，模擬骨骼肌彈性（12kPa）的培養基質是weiyi導致小鼠MuSC植入百分比有統計性顯著增加的條件（圖2C）。

       為確定具有植入潛力的培養細胞的比例，將MuSCs在柔軟或堅硬基質上培養1周，隨后稀釋分析。移植了培養于堅硬塑料性基質干細胞的小鼠，均未顯示出高于檢測閾值的BLI信號（圖2D紅圈）。相比之下，當移植1000個以上水凝膠（12kPa）培養的干細胞時，植入發生率為baifenzhibai（圖2D黑色圈），與新分離的細胞類似。僅移植10個水凝膠培養細胞的小鼠中，有10%植入（圖2E），與移植10個新分離細胞情況的水平（16%）相當。

圖2 培養MuSC的植入受基質彈性調節。（A）體內移植實驗方案。（B）受體小鼠移植100個GFP/Fluc MuSCs后1個月的BLI值散點圖，MuSCs在不同硬度基質上培養7天（左；n=15）。移植了不同培養條件下細胞的小鼠的生物發光圖像（右）。（C）高于植入閾值的BLI值實驗條件的百分比。Fisher’s精確檢驗P＜0.05。（D）Fluc MuSCs在水凝膠（黑色）或塑料（紅色）上培養7天，以不同數量移植1個月后，受體小鼠BLI值的散點圖。移植了不同培養條件下細胞的小鼠的生物發光圖像（右）。（E）各實驗條件下呈BLI值在植入閾值以上的移植后小鼠的百分比。

       體內移植時，培養于模擬肌肉組織的基質上的MuSCs展現出類似新分離MuSCs的動態增殖行為。兩細胞群都經歷了一個廣泛的增殖時期，最終到達平臺期并穩定，實現動態平衡（圖3A）。組織學鑒定GFP+肌纖維來源于再生，是由新分離或培養于柔軟基質上的MuSCs再生獲得（圖3B）。盡管新分離的與生長于柔軟基質的MuSCs得到的植入率相當（圖2C），但培養的MuSCs的植入范圍并不如新分離細胞那樣強勁（圖3A），表明要體外培養可能還需要額外的生化因素，以涵蓋實現體內zuida功能所需的其他關鍵微環境成分。培養于柔軟基質的MuSCs一旦移植到肌肉中，可恢復到其天然的衛星細胞微環境，這是新分離MuSCs的典型特征。從表達LacZ（受Myf5啟動子調控）的小鼠中分離MuSCs并培養于柔軟水凝膠上，隨后移植到小鼠中。收獲組織前，用虎蛇毒素（notexin）破壞受體肌肉，使MuSCs激活并使肌源性轉錄因子Myf5表達上調。組織學分析β-半乳糖苷酶染色發現，與新分離細胞類似，在基底層之下和肌纖維之上的衛星細胞微環境中，也發現了表達Myf5的移植水凝膠培養細胞（圖3C）。

圖3 于柔軟水凝膠中培養可促進肌肉干細胞植入及體內微環境重建。（A）通過BLI在移植后30天內監控新分離（黑線，方塊；500細胞）、柔韌基質（綠線，圓；1500細胞）、堅硬基質（紅線，菱形；1500細胞）上MuSCs的植入。（B）移植新分離（左；500移植細胞）或柔軟水凝膠培養1周（右；2500移植細胞）的MuSCs1個月后，肌肉橫切面免疫熒光檢測GFP表達。GFP，綠色；層粘連蛋白，紅色；Hoechst，藍色。（C）免疫組化分析移植了培養于柔軟基質MuSCs后1個月的橫向肌肉組織。箭頭所示為衛星細胞位置的供體源細胞。β-半乳糖苷酶,綠色；層粘連蛋白，紅色；Hoechst，藍色。

       干細胞的典型特征之一是可通過分裂或自我更新獲得更多拷貝。通過一些簡明的體外方法已證實MuSC培養時會發生不對稱和對稱分裂，與自我更新一致。本研究用分離自Pax7-ZsGreen轉基因小鼠的MuSCs，體外分析MuSC的基因表達，表明柔軟的基質支持自我更新。觀察到柔軟微孔中，32%的doublets（單個細胞分裂產生的兩個細胞）呈Pax7（MuSC標志物）陽性（圖4A,B）。相反，塑料微孔中只有6%的doublets陽性，表明柔軟基質可使MuSC擴增。盡管基因表達數據很有提示性，但體內功能分析還是必需的，以最終確定培養中發生了自我更新分裂時間。

       通過體內功能分析確定了干細胞發生了自我更新。以細胞群水平移植MuSC證實發生了植入（圖2和3），但并未最終表明培養中發生了自我更新分裂，因為細胞群中可能含有保持了干細胞特性的非分裂細胞。因此本實驗將MuSCs鋪于水凝膠微孔陣列中，并在鋪種細胞后立即成像，在培養后2-3天成像以識別只含1個doublet的微孔。用顯微操作器獲取并匯集5個微孔中的doublets，共10個細胞，如此，每只小鼠移植10個細胞（圖4A）。可檢測到BLI信號表明5個移植doublets中至少有1個發生了自我更新分裂，實現了植入。移植了培養于柔軟基質doublets的小鼠中，有25%（3/12）可檢測到植入（圖4C），并且促進肌纖維再生（圖4D頂部），提供了體內功能性證據，即柔韌基質培養的MuSC發生了自我更新分裂事件。生長于堅硬塑料微孔上的doublets移植后從未展現出植入（0/14）（圖4C），表明其再生潛力迅速喪失。

       即使多此分裂后，柔韌水凝膠上的MuSC也會自我更新。將分裂3-5次后的單細胞生長出的克隆移植到小鼠體內。結果發現移植了單克隆的小鼠有12%（1/8）展示出植入，證明柔韌基質上培養的MuSC即使多此分裂后依然保持自我更新能力（圖4C，D底部）。

圖4 于柔軟水凝膠培養可促進肌肉干細胞自我更新。（A）體內自我更新分析方案。（B）柔軟（n=47）或堅硬（n=32）微孔中，展現出Pax7+/+基因特征的doublets的百分比（右）。一個Pax7+/+ doublet的圖像（左）。天然Pax7-ZsGreen，綠色；Hoechst，藍色。（C）移植了柔軟（n=12）基質或堅硬（n=14）微孔中doublets，或柔軟微孔中克隆（n=8）的小鼠的生物發光值散點圖（左）。生物發光值在閾值以下的小鼠圖像（右）。（D）移植5個培養于柔軟水凝膠上的MuSC doublets（頂部，GFP+纖維縱向約13mm）或單個克隆（底部，纖維縱向約7mm）1個月后，肌肉橫切面免疫組化檢測GFP表達。GFP，綠色；層粘連蛋白，紅色；Hoechst，藍色。

結論

       本文探究了組織硬度（一種骨骼肌微環境的生物物理特性）對干細胞命運調節的影響力。通過用單細胞追蹤算法以單細胞水平審視MuSC行為，證明了柔軟基質可提高MuSC存活，防止分化并提升干細胞性。在小鼠中進行的功能性分析最終表明，柔韌基質允許培養中的MuSC自我更新。雖然潛在機制仍有待闡明，但可以假設硬度的減少改變了細胞形狀，引發細胞骨架重排及信號通路改變，從而保持了干細胞性。盡管對單一參數，硬度，干細胞性可顯著保留，但我們仍期望通過將額外的生化線索添加到平臺中來進一步增強干細胞性。利用如本文所述的這種仿生培養平臺進行的研究，可在促進體外增殖的同事保留干細胞性以及再生組織的能力，對干細胞研究具有廣泛影響，也是發展細胞療法的關鍵一步。

參考文獻：

Gilbert  P M ,  Havenstrite R L ,  Magnusson R E G , et al. Substrate elasticity  regulates skeletal muscle stem cell self-renewal in culture.[J].  Science, 2010, 329(5995):1078-1081.