產生具有所需線粒體DNA（mtDNA）序列的哺乳動物細胞有助于研究線粒體、疾病建模和潛在的再生療法。美國研究人員Alexander N. Patananan等開發了一種高通量線粒體轉移裝置——MitoPunch，通過將小鼠或人類細胞分離出的線粒體轉移到原代或永生的mtDNA缺陷（ρ0）細胞中，產生具有特定mtDNA-nDNA （核DNA）組合的細胞。穩定的分離線粒體受體（stable isolated mitochondrial recipient, SIMR）細胞經限制性培養基分離，能夠yongjiu保留供體mtDNA并重新獲得呼吸作用。然而，盡管在限制性培養基中生長，SIMR成纖維細胞仍保持ρ0樣細胞代謝組和轉錄組。研究人員將非永生的SIMR成纖維細胞重新編程為誘導多能干細胞（iPSC），隨后分化為多種功能細胞類型，包括間充質干細胞（MSC）、脂肪細胞、成骨細胞和軟骨細胞。重編程和分化后，SIMR成纖維細胞在分子和表型上與對照成纖維細胞類似。因此，使用MitoPunch能夠生產具有dute mtDNA-nDNA組合的SIMR細胞，可用于多種細胞類型的研究和應用。文章以“Pressure-Driven Mitochondrial Transfer Pipeline Generates Mammalian Cellsof Desired Genetic Combinations and Fates”為題發表于Cell Reports。

介紹

       哺乳動物線粒體是細胞的動力工廠，在細胞凋亡、活性氧（ROS）和Fe-S簇生成、Ca2+調節、代謝物產生方面有輔助作用。每個線粒體含超過1,100個由細胞核編碼并導入的蛋白質，其中大量拷貝為圓形約16.5 kbp的線粒體基因組（mtDNA），編碼13種電子傳遞鏈（ETC）和呼吸所需的蛋白質。多達1:5,000的人存在mtDNA突變，這種突變會損害高能量需求組織并引發衰竭性疾病，包括癌癥、糖尿病和代謝綜合征。此外，細胞可能包含不同mtDNA序列的混合物，這種情況被稱為異源性（heteroplasmy），多達1/8的無癥狀個體攜帶未知的致病性mtDNA突變。因此可控操縱mtDNA序列可以實現對線粒體的研究，并有可能開發mtDNA病的疾病模型或療法。

        在人類生殖領域已有幾種線粒體替換策略，可將受精卵中的致病mtDNA與健康供體卵母細胞中的無害mtDNA交換。這些方法有望防止mtDNA異常從攜帶者母親傳染給其子女。然而體外改變體細胞和組織內mtDNA序列的方法仍存在一定限制。細胞融合產生的“胞質雜合體（cybrids）”能夠yongjiu保留供體線粒體。此外導入線粒體的核酸內切酶可以通過靶向特定序列進行破壞，從而改變異質比率來改變線粒體和細胞功能。但這些核酸內切酶生產過于費力、局限于某些mtDNA序列、效率低，并且產物不同質。使用細菌胞苷脫氨酶（DddA）可編輯mtDNA單堿基序列，但效率低且脫靶率令其不盡如人意。

       目前有幾種方法可將分離的線粒體轉移到mtDNA缺陷細胞[稱為ρ0 (rho null)細胞]中，以恢復呼吸作用。此外還有研究報道了哺乳動物細胞對線粒體的內吞作用。然而這些研究的重點并不是挽救ρ0細胞及產生能夠yongjiu保留供體mtDNA的，穩定的分離線粒體受體（stable isolated mitochondrial recipient, SIMR）克隆。有研究通過將高濃度的分離的供體HEK293T線粒體與ρ0骨肉瘤細胞共培養，產生了數量有限的SIMR克隆。類似的還有細胞能夠內吞外源線粒體，甚至在有限的時間內（約1周）改變代謝功能，但這些外源mtDNAs會隨時間的推移而丟失。光熱納米葉片可解決這個問題，穩定地將少量分離的線粒體轉移到ρ0骨肉瘤細胞中。但納米刀片費時費力且產量低，三個SIMR克隆中有兩個改變了ρ0細胞代謝組。因此需要能夠產生大量非轉化的穩定克隆的新技術，以通過重編程產生多能性并分化為多種細胞類型來研究不同mtDNA-nDNA（核DNA）組合。

       本文描述了一種簡單易用的線粒體轉移技術，稱為“MitoPunch”，以快速生成大量未轉化的SIMR克隆。應用MitoPunch進行了一套“流水線”試驗，證明了供體mtDNA在不同細胞命運下的受體宿主原代細胞中具有功能。借由本研究建立的方法，利用非永生化材料產生了原代SIMR細胞。還以確定的mtDNA-nDNA組合測量了SIMR細胞的代謝組學、轉錄組學和生物物理性質狀態，對將來產生具有所需的mtDNA-nDNA組合的體細胞的研究具有指導作用。

結果

01-MitoPunch產生不同細胞類型和mtDNA的SIMR細胞

        MitoPunch是一個基于光熱納米刀片和生物光子激光輔助細胞手術工具（biophotonic laser-assisted cell surgery tool, BLAST）技術的大規模并行、壓力驅動的大型轉運平臺。MitoPunch使用機械柱塞使柔韌的聚二甲基硅氧烷（PDMS）儲器發生物理變形，儲器中含1×PBS（pH 7.4）分離的線粒體懸浮液（圖1A）。柱塞驅動推動PDMS輸送室中的懸浮物通過多孔膜，多孔膜包含許多直徑3μm的孔，生長有一層粘附細胞。這種作用直接迫使分離的線粒體進入受體細胞的胞質溶膠。

        為證實MitoPunch能夠產生SIMR細胞，將分離自約1.5 × 107個HEK293T細胞的線粒體轉移至約2 × 105個143BTK-ρ0骨肉瘤細胞中。轉移后使用尿苷缺乏培養基選擇并分離能夠yongjiu保留供體mtDNA的SIMR克隆。由于呼吸缺陷型ρ0細胞具有無活性的二氫硼酸脫氫酶，并且依賴外源尿苷或恢復呼吸來進行嘧啶生物合成，因此這種篩選是可行的。對比同數量線粒體與細胞的共孵育實驗，只有MitoPunch產生的帶有HEK293T線粒體的143BTK-ρ0細胞（143BTK-ρ0+HEK293T）yongjiu保留了供體mtDNA，并在尿苷缺乏的培養基選擇中存活（圖1B）。在一組有代表性的線粒體轉移實驗中，MitoPunch產生了約75個獨立的結晶紫染色的SIMR克隆，相比之下共孵育沒有獲得克隆（圖1B）。

       接下來研究MitoPunch否能產生帶有明確mtDNA-nDNA對（能夠傳遞線粒體疾病特征）的SIMR克隆。線粒體分別來自含A3243G mtDNA替代物的胞質雜合體，該突變常與線粒體腦病、乳酸性酸中毒和卒中樣發作（MELAS）相關，以及同一個體野生型（WT）細胞。已知A3243G點突變位于tRNALEU基因，會導致ETC復合物的產生和組裝發生改變，使氧化磷酸化受損。MitoPunch將線粒體導入143BTK-ρ0受體細胞并選擇培養2周后，獲得數十個yongjiu保留MELAS（143BTK-ρ0+MELAS）或WT（143BTK-ρ0+WT） mtNDA的獨立SIMR克隆，用Seahorse Extracellular Flux Analyzer測試其中2個克隆的耗氧率（OCR）。結果顯示與患者匹配的143BTK-ρ0+WT和天然143BTK對照細胞相比，143BTK-ρ0+MELAS克隆的基礎呼吸、zuida呼吸和備用呼吸能力顯著受損（圖1C ），表明MELAS表型的主要代謝缺陷已通過的穩定mtDNA轉移實現。

       擴大線粒體供體和受體細胞配對范圍，以證明MitoPunch的多功能性。從C57BL/6小鼠組織中分離線粒體，MitoPunch將其轉移到C3H/An衍生的L929 ρ0永生化成纖維細胞中。選擇兩周后每個線粒體來源產生了幾十個SIMR克隆。相較于接受了低能量需求的脾或shenyuan線粒體的SIMR克隆來講，接受高能量需求的心臟、肺或肌肉源線粒體產生的SIMR克隆顯示出zuiqiang健的呼吸特征（圖1D）。還評估了用MitoPunch將異質mtDNA混合物導入細胞。選擇有mtDNA突變的小鼠胞質雜合體系分離線粒體，分別為細胞色素B（mt-Cytb）、NADH脫氫酶亞基4（mt-nd4）和NADH脫氫酶亞基6（mt-nd6）基因突變，使用MitoPunch將線粒體單獨或與蛋白1:1比例轉移到L929 ρ0成纖維細胞中。具有單一突變mtDNA源的SIMR細胞繼續表現出嚴重的呼吸損傷（圖1E）。而含有非重疊突變線粒體基因的SIMR細胞顯示出明顯改善的呼吸特征，有力表明兩種線粒體基因都得到穩定保留（圖1E）。因此MitoPunch和細胞篩選可作為一種通用方法，來產生具有所需mtDNA-nDNA對的人或小鼠SIMR細胞。將多種類型的mtDNA共轉移到同一受體細胞中，也可作為檢測突變mtDNA混合物的互補的一種簡單方法。

圖1 MitoPunch是一種多功能線粒體轉移技術。（A）MitoPunch線粒體轉移平臺示意圖。（B）共孵育或MitoPunch傳遞，1×PBS（pH7.4）（對照）或HEK293T細胞線粒體，轉移到143BTK-ρ0骨肉瘤細胞中，去尿苷培養基篩選后的結晶紫染色SIMR克隆。數據為3次技術重復的均值±SD。（C）Seahorse XF96 Extracellular Flux Analyzer 測量的OCR，分別為約1.5×104的143BTK-、143BTK-ρ0、WT cybrid、MELAS cybrid, 143BTK-ρ0+MELAS SIMR、143BTK-ρ0+WTSIMR。數據為4次技術重復的均值±SD。

02-MitoPunch產生非轉化的非惡性SIMR細胞

       為使用非永生化受體細胞獲得含mtDNA-nDNA組合的SIMR細胞，建立了一套人成纖維細胞線粒體受體傳遞方法。用2’,3’-dideoxycytidine (ddC)處理Hayflick-limited BJ包皮（BJ）成纖維細胞、新生皮膚成纖維細胞（NDFs）和成人皮膚成纖維細胞（ADFs）3周，以耗盡內源性mtDNA。原代ρ0人成纖維細胞分別用qPCR和Seahorse assay檢測不到mtDNA（圖S1A和S1B）和細胞呼吸（圖S1C和S1D）。由于ddC可能導致nDNA改變，通過全基因組測序檢查了BJ ρ0成纖維細胞，發現只有少數非同義突變，平均每兆堿基0.6個突變，沒有染色體斷裂，DNA拷貝數也沒有變化（表S1）。

       將從人外周血單核細胞（PBMC1）分離的線粒體轉移到新鮮ρ0成纖維細胞中，隨后尿苷缺乏的半乳糖培養基選擇。從5-10個BJ成纖維細胞、NDFs或ADFs中，分離出ρ0+PBMC1 SIMR克隆，克隆顯示了正確的mtDNA-nDNA序列對和人白細胞抗原（HLA）受體細胞單倍型（圖2A–2C）。獨立的PBMC2和HEK293T細胞線粒體轉移也獲得了原代、非永生的SIMR克隆。觀察到HEK293T細胞和PBMC2線粒體轉移的效率多變，ADFs ρ0+PBMC2沒有產生克隆（圖S1E）。對含23個BJ ρ0+HEK293T SIMR克隆的大量培養物的分析證實了mtDNA-nDNA對以及HLA單倍型正確（圖S1F和S1G）。

        通過Seahorse assay檢測BJ ρ0+PBMC1和BJ ρ0+HEK293TSIMR成纖維細胞的呼吸功能，結果顯示與BJ ρ0成纖維細胞相比，兩種SIMR細胞類型的基礎和zuida呼吸以及備用呼吸能力均有統計學改善，盡管仍低于對照BJ成纖維細胞的水平（圖2D和S1H）。免疫熒光（IF）顯微顯示，BJ ρ0成纖維細胞具有片段化的線粒體網絡形態，缺乏含mtDNA的線粒體類核，如之前對ρ0細胞觀察到的那樣（圖2E）。相比之下天然的BJ成纖維細胞顯示出網狀線粒體網絡，每個細胞有幾十個線粒體類核（圖2E）。根據IF類核斑點數，BJ ρ0+PBMC1和BJ ρ0+HEK293T SIMR細胞似乎都將mtDNA含量恢復到相當于或超過天然BJ成纖維細胞的水平（圖2E和S1I）。SIMR細胞線粒體顯示出類似于天然BJ成纖維細胞的網狀線粒體網絡形態，盡管具有更密集和更腫脹的線粒體（圖2E和S1I）。盡管SIMR成纖維細胞yongjiu地保留了供體mtDNA，OCR和IF顯示轉移的mtDNA的同化作用導致細胞特征處于BJ ρ0和天然BJ成纖維細胞之間。

圖2 SIMR成纖維細胞的產生。（A）從ρ0原代人成纖維產生SIMR細胞的選擇流程（天），以及SIMR克隆生產效率數據。從約3×107個PBMC1分離的線粒體經MitoPunch轉移到BJ ρ0、NDF ρ0或ADF ρ0受體成纖維細胞中。選擇培養后，SIMR克隆用結晶紫染色并計數。（B）BJ、PBMC1、BJ ρ0+PBMC1 SIMR成纖維細胞的D-loop高變區mtDNA序列。箭頭表示單核苷酸多態性。（C）用OptiType v.1.3.1算法獲得的天然BJ、BJ ρ0、BJ ρ0+PBMC1 SIMR成纖維細胞的主要組織相容性復合體HLA A、B、C的基因座基因分型。（D）Seahorse XF96 Extracellular Flux Analyzer測量的約1.5×104數量的天然BJ、BJ ρ0、BJ ρ0+PBMC1 SIMR成纖維細胞的OCR。數據為4次技術重復的均值±SD。unpaired, two-tailed Student’s t test測量顯著性。（E）天然BJ、BJ ρ0、BJ ρ0+PBMC1 SIMR成纖維細胞免疫染色代表圖像，雙鏈DNA（dsDNA）（綠色）、TOM20（紅色）、共定位（黃色）。圖像（100×）由Leica SP8共聚焦顯微鏡獲得，比例尺15μm。也可見圖S1和表S1。

03-SIMR成纖維細胞是可重編程的

       用OCT4、SOX2、KLF4、cMYC、NANOG和LIN28 RNAs使BJ ρ0+PBMC1和BJ ρ0+HEK293TSIMR成纖維細胞以及天然BJ成纖維細胞重編程，并對TRA-1-60+染色克隆定量。兩個獨立實驗中，天然BJ成纖維細胞產生平均136個重編程的TRA-160+克隆（0.068%），而BJ ρ0+PBMC1和BJ ρ0+HEK293T細胞分別產生21個（0.011%）和3個（0.0015%）克隆（圖3A和S1J）。檢測了BJ ρ0+PBMC1-iPSCs （1、2和11）和BJ ρ0+HEK293T-iPSCs （1、2和4）的三個重編程克隆的多能性生物標記物，并通過流式細胞術檢測OCT3/4和SOX2轉錄因子染色陽性，BJ誘導的iPSC對照也是如此（圖3B和S1K）。相反在所有重編程的BJ ρ0+PBMC1-iPSC、BJ ρ0+HEK293T-iPSC和對照BJ-iPSC克隆中，分化細胞生物標志物CD44均為陰性，僅在天然BJ成纖維細胞中免疫染色（圖3B和S1K）。IF檢測BJ-iPSC和所有SIMR-iPSC重編程克隆也是SSEA-4+和OCT4+（圖3C和S1L）。Seahorse分析BJ ρ0+PBMC1-iPSC和BJ ρ0+HEK293T-iPSC克隆顯示，在基礎呼吸、zuida呼吸和備用呼吸能力上，與天然BJ-iPSC的統計差異最小或沒有（圖3D和S1M）。因此SIMR成纖維細胞重編程產生了帶有供體mtDNA的iPSCs。

圖3 SIMR成纖維細胞可被重編程。（A）用顯微鏡計數的TRA-1-60+的iPSCs克隆，由天然BJ和SIMR成纖維細胞重編程獲得。數據為生物重復平均值。BJ成纖維細胞對照的數據為圖S3A中同一數據。（B）流式細胞術測定多能性生物標志物SOX2和OCT3/4，以及成纖維細胞生物標志物CD44。免疫染色樣品以彩色顯示，同型陰性對照以灰色顯示。所示為天然BJ成纖維細胞和BJ-iPSC以及BJ ρ0+PBMC1-iPSC細胞數據。天然BJ成纖維細胞和BJ-iPSCs的數據與圖S3B相同。（C）天然BJ成纖維細胞（陰性對照）、BJ-iPSC（陽性對照）和三個BJ ρ0+PBMC1-iPSC克隆的代表性相差圖像及IF顯微圖像，對多能性生物標志物SSEA-4和OCT4進行免疫染色。比例尺100μm。（D）約1.5×104個天然BJ-iPSCs和BJ ρ0+PBMC1-iPSC克隆1、2和11的OCR測量值。BJ-iPSC對照的數據與圖S3D相同。數據為4次技術重復的均值±SD。unpaired, two-tailed Student’s t test計算顯著性。另見圖S1和表S2。

       有研究表明致病性mtDNA突變個體的成纖維細胞發生了iPSC重編程，但還沒嘗試用于含供體的、非天然突變mtDNA的SIMR成纖維細胞。因此研究人員分離了含A3243G MELAS mtDNA突變或WT mtDNA的線粒體，由MitoPunch轉移到BJ ρ0成纖維細胞中并選擇。BJ ρ0+MELAS SIMR成纖維細胞在重編程過程中表現出增殖缺陷，并且不產生iPSCs（數據未顯示）。因此改用NDF ρ0受體成纖維細胞，使用MELAS（NDF ρ0+MELAS）、WT（NDF ρ0+WT）或NDF（NDF ρ0+NDF）線粒體產生SIMR成纖維細胞。Seahorse分析顯示，與天然NDF、NDF ρ0+NDF和NDF ρ0+WT相比，NDF ρ0+MELAS成纖維細胞的基礎呼吸、zuida呼吸和備用呼吸能力顯著降低（圖S1N）。限制性片段長度多態性（RFLP）PCR分析證實產生了同質NDF ρ0+MELAS SIMR成纖維細胞（圖S1O）。RFLP分析還證實產生了約25%-50%的異質NDF ρ0+MELAS/WT成纖維細胞（圖S1O）。同質NDF ρ0+MELAS成纖維細胞用前文RNA方法進行同樣的重編程，但所有發育中的iPSC克隆都發生了自發分化（圖S1P）。NDF ρ0+MELAS/WT異質成纖維細胞的重編程（圖S1O）產生20個iPSC克隆，但RFLP分析發現所有克隆僅保留了WT mtDNA（圖S1P和S1Q）。為檢驗重編程方法是否影響突變型mtDNA SIMR-iPSC的產生，用整合DNA、慢病毒和仙臺病毒重編程NDF ρ0+MELAS成纖維細胞。在所有情況下，盡管有重編程的早期跡象，NDF ρ0+MELAS細胞還是自發分化（表S2）。此外在補充尿苷、抗氧化劑N-acetylcysteine [Rho相關蛋白激酶（ROCK）抑制劑]或低氧張力進行重編程時，均未獲得NDF ρ0+MELAS-iPSCs（數據未顯示）。另外4種包含額外mtNDA突變的NDF ρ0 SIMR成纖維細胞重編程策略也獲得了類似的結果，突變包括細胞色素B缺失、Kearns-Sayre常見缺失、A8344G或T8993G mtDNA替換（表S2）。因此SIMR成纖維細胞容易保持大量的mtDNA序列，與SIMR-iPSCs相反，后者只能用無害的mtDNA序列產生。需要進一步的生化研究來確定mtDNA序列如何決定SIMR重編程。

04-SIMR-iPSCs產生功能性的、分化的細胞類型

       接下來確定了具有等基因核和非天然供體mtDNA的SIMR-iPSCs能否分化。鑒于間充質干細胞（MSCs）在治療及多項臨床試驗中的應用潛力，選擇其作分化研究對象。BJ-iPSC對照、BJ ρ0+PBMC1-iPSC和BJ ρ0+HEK293T-iPSC被分化為MSC，并用針對表面生物標志物的抗體組進行驗證。流式細胞術驗證了BJ BJ-MSC對照、BJ ρ0+PBMC1-MSC克隆和BJ ρ0+HEK293T-MSC克隆中，MSC生物標志物CD73、CD90和CD105呈陽性，非MSC生物標志物cocktail呈陰性，包括CD11b、CD19、CD34、CD45和HLA-DR（圖4A和S1R）。BJ-MSCs和來自兩個mtDNA供體的所有SIMR-MSC克隆都可粘附在塑料上，符合ISCT的MSCs標準（圖4B和S1S）。

       Seahorse分析BJ-MSC對照、BJρ0+PBMC1-MSC克隆和BJ ρ0+HEK293T-MSC克隆顯示，基礎呼吸、zuida呼吸和備用呼吸能力沒有差異或略有差異，表明ρ0成纖維細胞在MitoPunch及重編程和分化后，呼吸變化并不穩定（圖4C和S1T）。定量相位顯微（QPM）檢查SIMR MSCs的關鍵細胞生物物理特性，發現BJ-MSC對照、BJ ρ0+PBMC1-MSC克隆和BJ ρ0+HEK 293T-MSC克隆的細胞生長率、面積和生物量差異極小或無差異（圖4D和S1U）。通過標準免疫抑制試驗（可檢測MSC臨床免疫調節性能），與人PBMC分離的T細胞共培養，比較SIMR-MSC克隆和BJ-MSC對照的功能。發現所有BJ ρ0+PBMC1-MSC和BJ ρ0+HEK293T-MSC克隆都抑制T細胞增殖（圖4E和S1V）。BJ ρ0+PBMC1-MSC克隆11顯示出zuida的免疫抑制和T細胞增殖的減少，而其余SIMR-MSC克隆和BJ-MSC對照間沒有檢測到大的差異。最后對SIMR-SMR進行定向三向分化：脂肪細胞、成骨細胞和軟骨細胞，以證明MitoPunch工程細胞系的臨床潛力。結果BJ-MSC對照、BJ ρ0+PBMC1-MSCs和BJ ρ0+HEK293T-MSCs都形成了這三種MSC分化譜系（圖4F和S1W）。BJ對照組和SIMR克隆組的脂肪細胞和軟骨細胞在表型上相似，而SIMR成骨細胞傾向于產生更多的鈣沉積。因此本文的線粒體轉移策略通過穩定摻入特定的、無害的、非天然的供體mtDNAs，能夠由ρ0成纖維細胞產生iPSCs、MSCs和進一步分化的細胞類型。

圖4 SIMR iPSCs產生具有三細分化潛力的MSCs。（A）流式細胞術檢測MSC生物標志物CD73、CD90和CD105，以及非MSCs生物標志物cocktail。有顏色為免疫染色樣品，同型陰性對照用灰色表示。BJ-MSC對照的數據與圖S5A數據相同。圖示為天然BJ-MSCs和BJ ρ0+PBMC1-MSCs代表性克隆。（B）明視野顯微鏡顯示未處理的BJ-MSC和BJ ρ0+PBMC1-MSC克隆1、2和11黏附到塑料上，20×放大（比例尺100μm）。BJ-MSC對照數據與圖S5B數據相同。（C）約1.5×104天然BJ-MSCs和BJ ρ0+PBMC1-MSC克隆1、2和11的OCR測量值。BJ-MSC對照數據與圖S5C相同。數據為3次技術重復的均值±SD。unpaired, two-tailed Student’s t test檢驗顯著性。（D）天然BJ-MSCs以及BJ ρ0+PBMC1-MSC克隆1、2、11的1:1:1混合的定量相位顯微。BJ-MSC對照數據與圖S5D相同。圖為帶有異常值的箱線圖。數據分別為77天然BJ-MSCs和172 BJ ρ0+PBMC1-MSCs的均值。Welch’s t test檢測顯著性。（E）分別以T細胞：MSC = 1:2、1:1、5:1和10:1的比例，將T細胞加入到天然BJ-MSC或BJ ρ0+PBMC1-MSC克隆1、2或11培養物中。共培養5天后，流式細胞術和CFSE染料稀釋法測定T細胞增殖。“NS”(無刺激)標記表示沒有CD3/CD28珠激活的T細胞。“-ve”(陰性)標記表示刺激的T細胞中沒有添加MSCs。“+ve”(陽性)標記表示骨髓源性抑制細胞與T細胞的比例為1:1。數據為3次技術重復的平均值。（F）天然BJ-MSCs和BJ ρ0+PBMC1-MSC克隆1、2和11的三細分化。切片固定并分別用1 μM Bodipy 493/503、1%茜素紅S和0.1%番紅O染色。所示為脂肪細胞(diyi行，20×；比例尺100μm)，骨細胞(第二行，20×；比例尺200μm)和軟骨細胞(第四行，5×；比例尺500μm)。另見圖S1。

05-SIMR細胞代謝及RNA轉錄物隨細胞命運轉變而改變

       使用超高效液相色譜-質譜（UPHLC-MS）對154種穩態代謝物進行定量，試驗細胞包括成纖維細胞、iPSC和MSC命運的天然BJ、BJ ρ0、BJ ρ0+PBMC1克隆和BJ ρ0+HEK293T克隆。層次聚類顯示了獨立于線粒體轉移狀態的成纖維細胞、iPSCs和MSCs的不同分組特征（圖S2A和S2B表S3）。代謝物數據的主成分分析（PCA）也顯示了代表成纖維細胞、iPSC和MSC命運的三個主要簇，但每個命運中SIMR和天然對照細胞間沒有明顯差異（圖S2C和S2D）。BJ ρ0+PBMC1-iPSC和BJ ρ0+PBMC1-MSC克隆的代謝物組變異分析（MSVA）和歐幾里德距離分析顯示，它們自身與各自的BJ-iPSC和BJ-MSC對照具有相似的代謝物途徑情況（圖S2A、S2E和S2F）。相比之下，BJ ρ0+HEK293T-iPSC克隆1和2與克隆4和BJ-iPSC對照有幾個代謝途徑有區別，特別是嘌呤、嘧啶、glutathione和乙醇代謝（圖S2B、S2E和S2F）。在進一步分化為BJ ρ0+HEK293T-MSC克隆后，BJ ρ0+HEK293T-iPSC克隆中的這種差異不再存在（圖S2B、S2E和S2F）。總之，穩態代謝物分析顯示，SIMR細胞與天然對照細胞相當，僅有的少數差異在iPSC重編程并向MSCs分化時可以得到解決。

       利用RNA測序（RNA-Seq）評估成纖維細胞、iPSC和MSC命運的SIMR細胞中的全轉錄組。DESeq2用于識別顯著差異表達的基因（DEGs），定義為改變倍數曲log2大于0.5，校正后p < 0.05的基因。對于BJ ρ0+PBMC1和BJ ρ0+HEK293T SIMR細胞，與天然BJ對照細胞相比，成纖維細胞命運時有zuida數量的DEGs，校正后p < 0.05（圖5A和S3A）。將成纖維細胞、iPSC和MSC命運的BJ ρ0+PBMC1細胞分別與天然BJ親代細胞進行比較，RNA-seq分別識別出1741、194和224個升高的，1827、68和115個抑制的DEGs（圖5A；表S4）。對獨立產生的BJ ρ0+HEK293T細胞進行轉錄組分析，成纖維細胞、iPSC和MSC命運中與天然BJ親代細胞相比，分別有1,377、537和239升高，1,564、648和210抑制的DEGs（圖S3A表S4）。

       DEGs的反應途徑富集分析顯示，與天然BJ成纖維細胞相比，SIMR成纖維細胞轉錄譜中的不同途徑發生了改變，包括與細胞外基質組織和補體級聯相關的途徑（圖S3B表S5）。將所有SIMR-iPSC和SIMR-MSCs分別與天然BJ-iPSC和BJ-MSC對照比較，進行差異表達和途徑富集分析，確定的DEGs數量顯著較少，過多的途徑主要由組蛋白轉錄物簇驅動（圖S3C和S3D表S5）。

       進一步詳細的轉錄組分析揭示了基于細胞狀況和命運的代謝途徑差異。體細胞重編程為iPSCs需要代謝轉變，從主要氧化磷酸化轉為主要糖酵解，對應所有基因組變異分析（GSVA）顯示糖酵解相關轉錄物表達增加的BJ ρ0+PBMC1-iPSC和BJ ρ0+HEK 293 IPSc克隆（圖S4A和S4B）。此外GSVA顯示，在BJ ρ0、BJ ρ0+PBMC1和BJ ρ0+HEK293T SIMR成纖維細胞中，ETC轉錄物的表達較天然BJ成纖維細胞中多（圖S4A和S4B）。然而免疫印跡顯示，琥珀酸脫氫酶（SDHB；復合體II）、泛醇-xibaosesu c還原酶核心蛋白2（UUQCRC2；復合物Ⅲ）、細胞色素氧化酶Ⅱ（MT-COXII；復合體Ⅳ），和ATP合酶F1亞單位α（ATP5A；復合物V）結果相反，SIMR成纖維細胞中的ETC蛋白較天然BJ成纖維細胞對照減少（圖S4C）。總的來說，全轉錄組數據分析顯示，SIMR克隆和天然對照細胞在成纖維細胞命運上最初的巨大差異在重編程和分化過程中逐漸消失。

       檢測了MitoCarta2.0數據庫中列出的1,158個核基因的RNA轉錄水平，這些基因編碼的蛋白定位于線粒體。對來自這些基因的轉錄物的分級聚類分析可在成纖維命運時將BJ ρ0+PBMC1、BJ ρ0+HEK293T和BJ ρ0轉錄物與天然BJ轉錄物分離出來（圖5B和S3B）。兩組間DEGs的途徑分析顯示，天然BJ成纖維細胞中編碼ETC蛋白的基因富集（表S4）。值得注意的是，iPSC和MSC命運下沒有觀察到這種差異聚類（圖5B和S5A）。

       進一步對mtDNA編碼的轉錄物檢查發現，與來自SIMR和天然成纖維細胞的轉錄物相比，BJ ρ0細胞中所有13種編碼基因轉錄物的表達顯著降低，類似（圖5C和S5B）。此外與天然BJ成纖維細胞相比，BJ ρ0+PBMC1和BJ ρ0+HEK293T成纖維細胞13種mtDNA編碼基因的表達均顯著降低（圖5C和S5B）。相比之下，在將SIMR和對照成纖維細胞重編程為iPSCs，然后分化為MSCs后，在mtDNA轉錄水平上沒有觀察到顯著差異（圖5C和S2B）。

       然后使用MitoXplorer管道量化已識別的DEGs中38個不同線粒體過程的表示。正如呼吸作用消失所預期的那樣，與天然BJ成纖維細胞相比，BJ ρ0成纖維細胞中展示出29個線粒體過程DEGs，特別是氧化磷酸化、線粒體基因組翻譯和氨基酸代謝過程中（圖5D）。類似地，與天然BJ成纖維細胞相比，BJ ρ0+PBMC1和BJ ρ0+HEK293T成纖維細胞分別在30和29個線粒體過程中改變了基因表達譜（圖5D和S1C）。使用MitoXplorer的進一步分析突出了兩個SIMR系之間的差異，因為與BJ ρ0+HEK293T成纖維細胞相比，BJ ρ0+PBMC1在mtDNA相關氧化磷酸化和線粒體基因組翻譯方面的DEGs更少。此外與天然BJ成纖維細胞相比，兩種SIMR成纖維細胞系中，與細胞核編碼的線粒體翻譯和鈣信號傳遞相關的DEGs都比BJ ρ0系更多。值得注意的是，通過重編程，受影響的線粒體過程的數量顯著減少，在BJ ρ0+PBMC1-iPSCs和BJ ρ0+HEK293T-iPSCs中分別只有7個和16個過程顯示DEG（圖5D和S1C）。最后，BJ ρ0+PBMC1-MSCs和BJ ρ0+HEK293T-MSCs分別只顯示出3和8個帶有DEGs的線粒體過程，在兩個SIMR-MSCs系和MSCs對照之間只有ROS防御類似地改變（圖5D和S1C）。這些數據揭示了在其他線粒體過程中，成纖維細胞命運中翻譯的轉錄組改變，作為外源性mtDNA功能在SIMR細胞中的潛在差異標記。綜上所述，盡管重編程及分化后，SIMR細胞線粒體功能變得與BJ對照組更加相似，但基于轉移的mtDNA序列的差異仍然存在。

圖5 SIMR和天然mtDNA細胞的轉錄組特征。（A）BJ ρ0+PBMC1細胞與天然BJ細胞在成纖維細胞、iPSC和MSC命運時的DEGs數目比較。（B）核編碼MitoCarta2.0數據庫基因的層次聚類，分別來自成纖維細胞、iPSC和MSC命運的天然BJ、BJ ρ0和BJ ρ0+PBMC1細胞。（C）標準化、批量校正后的read計數箱線圖，分別為成纖維細胞、iPSC和MSC命運的天然BJ、BJ ρ0和BJ ρ0+PBMC1細胞中，13個MitoCarta2.0注釋的mtDNA編碼基因。Welch’s t test檢驗顯著性。（D）MitoXplorer歸類后的DEGs，為BJ ρ0+PBMC1分別與成纖維細胞、iPSC和MSC命運的天然BJ細胞相比，分為38個線粒體過程。另參見圖S2、S3、S4、S5以及表S3、S4和S5。

討論

       本研究使用MitoPunch開發了一種快速、通用的線粒體傳遞方法，可產生具有特定mtDNA-nDNA組合的轉化或非永生細胞，相對于cybrid技術有很大優勢，cybird無法可控選擇生理線粒體，或篩選具有所需mtDNA突變的細胞較為耗時。本研究表明，SIMR成纖維細胞的轉錄組和代謝組與ρ0受體細胞類似，并且重編程為多能性及隨后的分化可將其重置為非常類似于未處理的對照細胞。使用其他線粒體轉移方法，如不能重新編程的永生細胞系，將無法或很難實現本研究。雖然通過納米刀片和顯微注射也可以產生SIMR細胞，但這些低通量也存在局限性。相比之下MitoPunch能夠在2周內產生大量含期望的、穩定的mtDNA-nDNA組合的克隆。

       制備用于ρ0受體成纖維細胞研究的SIMR克隆已實現。一些mtDNA-nDNA組合產生SIMR克隆的效率較低，只能用MitoPunch這種高通量平臺來檢測。對比143BTK-ρ0+HEK293T SIMR細胞產生約75個克隆，MitoPunch轉移到原代成纖維細胞產生的SIMR克隆較少，可能與Hayflick極限或對MitoPunch程序的次優反應有關。如ADF ρ0受體生長最慢，在mtDNA耗盡后不久達到衰老（數據未顯示），導致最少的SIMR克隆。平均而言，與BJ ρ0+PBMC1克隆相比，獲得的BJ ρ0+HEK293T克隆為2倍左右，這可能與mtDNA-nDNA對相容性和代謝情況有關。SIMR成纖維細胞的重編程效率較天然成纖維對照組也降低了10倍。在非天然mtDNA小鼠胚胎成纖維細胞重編程中觀察到了類似的減少，可能是由于mtDNA-nDNA相容性較低。

       通過轉錄組數據觀察到SIMR成纖維細胞中mtDNA-nDNA同化作用不*，顯示SIMR成纖維細胞和未被操縱的成纖維細胞之間有數百個DEGs。此外，盡管SIMR細胞在限制性培養基中培養需要ETC活性才能生長和存活，但SIMR和ρ0成纖維細胞的MitoCarta2.0和mtDNA編碼的轉錄物最相似。這些數據表明，SIMR成纖維細胞中的外源性mtDNA不能*溝通和影響nDNA，盡管能夠支持選擇性水平的ETC活性和細胞增殖代謝物的充分合成。支持這一觀點的證據包括ddC暴露產生的nDNA損傷最小，SIMR成纖維細胞的代謝組和轉錄組譜在SIMR-iPSCs中大多被重置為未處理的BJ-iPSC譜。本文結果與一份報告一致，有報告稱ρ0細胞的新陳代謝和表觀基因組已經發生改變，形成胞質雜合體只能部分重置，本文結果與此一致。本文為研究穩定mtDNA移植及細胞命運改變后ρ0細胞轉錄和代謝的重置提供了一個平臺。通過其他形式的線粒體轉移接受外源mtDNA的細胞中，mtDNA轉錄譜是否也被擾亂需要進一步研究驗證。

       總之，本研究提供了一個原理性的線粒體轉移途徑，能夠產生具有特定mtDNA-nDNA組合的不同命運的細胞，包括具有自然界中沒有的基因組配對的克隆系。未來的研究將產生代表高能量需求組織的SIMR衍生細胞，如心肌細胞或神經元，以及目前無法產生的含有突變mtDNA的SIMR-iPSCs，以使mtDNA病患者特異性疾病和具有等基因核的藥物篩選模型成為可能。此外本研究結果表明，線粒體轉移實驗的解釋必須考慮到最初產生的細胞可能不顯示*的mtDNA-nDNA整合及隨后的細胞途徑恢復。這對于缺乏后續重編程潛力的細胞，如瞬時或轉化的線粒體轉移細胞系來說尤其顯著，因為研究結果表明重編程和分化是重置nDNA表達譜所必需的。最后，本文的線粒體轉移途徑繞過了細胞中mtDNA和nDNAs的進化成對選擇，擴展了人類群體中存在的基因組組合庫，并產生了具有確定的mtDNA-nDNA組合和dute功能特性的不同命運的細胞庫，用于研究和潛在的治療應用。

參考文獻：

Patananan,  A. N. , et al. "Pressure-Driven Mitochondrial Transfer Pipeline  Generates Mammalian Cells of Desired Genetic Combinations and Fates."  Cell Reports 33.13(2020):108562.