分子伴侶能夠調(diào)節(jié)人類蛋白質(zhì)組的質(zhì)量控制，其中涉及許多疾病，包括心力衰竭。BAG3基因（編碼共伴侶蛋白）的突變與遺傳性和散發(fā)性擴張型心肌病引起的心力衰竭有關。家族性BAG3突變是常染色體顯性的，經(jīng)常導致編碼序列的截短，引發(fā)雜合子功能喪失機制。然而BAG3基因雜合子敲除鼠并沒有表現(xiàn)出可檢測的疾病表型。為了在人類系統(tǒng)中建立BAG3心肌病模型，美國研究人員Luke M. Judge等利用人類誘導多能干細胞（iPSCs）產(chǎn)生了一系列BAG3功能缺失突變的心肌細胞（iPS-CMs）。BAG3突變雜合子降低了iPS-CMs的蛋白質(zhì)表達，破壞了肌原纖維結構，損害了收縮功能。當暴露于已知會引起心臟毒性的蛋白酶體抑制劑時，BAG3缺陷的iPS-CMs對進一步的肌原纖維斷裂和收縮功能障礙特別敏感。對內(nèi)源性BAG3蛋白進行親和標記和質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學，進一步確定了人類心臟中BAG3協(xié)調(diào)的心臟保護伴侶復合物。最后基于這些結果建立了一個模型，用于評估人心肌細胞中的蛋白質(zhì)質(zhì)量控制途徑及其作為心臟藥物毒性的治療靶點和易感因素的潛力。研究成果以“A BAG3 chaperone complex maintains cardiomyocyte function duringproteotoxic stress”為題發(fā)表于JCI insight。

背景

       人的一生中心肌細胞必須保持有恒定的收縮功能，因此細胞會經(jīng)歷連續(xù)的機械和氧化應激，而這會引發(fā)蛋白質(zhì)損傷和錯誤折疊，可能損害收縮功能，并導致有毒肽的形成和聚集。已知心臟幾乎沒有什么再生能力，因此心肌細胞必須嚴格地調(diào)節(jié)新蛋白質(zhì)合成、降解受損蛋白質(zhì)成分，以補償這種蛋白毒性應激。為此，心臟組織保持了高水平的組成型和組織特異xing伴侶蛋白，罕見的伴侶蛋白突變可能會導致嚴重的疾病。

       蛋白質(zhì)量控制途徑在遺傳性和散發(fā)性心臟病中扮演重要角色，也是潛在的治療靶點。輔助伴侶蛋白BAG3是一個值得關注的分子，因為遺傳證據(jù)表明BAG3變體既youbing理性的，也有保護性的。如罕見的P209L錯義突變會導致嚴重的肌原纖維肌病，這是一種兒童期發(fā)病、會影響骨骼肌和心肌的致命疾病，BAG3蛋白可能會增加其功能毒性。此外BAG3有多種雜合突變，其中許多是與功能喪失一致的無義或移碼突變，導致常染色體顯性家族性擴張型心肌病。BAG3還與獲得性心肌病有關，如應激性（Takotsubo）心肌病。而BAG3中的一個常見編碼多態(tài)性，又與特發(fā)性擴張型心肌病發(fā)生的顯著降低相關，表明該多態(tài)性可能具有保護作用。動物模型中，通常利用BAG3突變或缺失制作肌病表型。然而在小鼠中敲除BAG3基因產(chǎn)生的結果不一致：一組呈原發(fā)性肌病表型，另一組則是沒有明確肌肉表型的全身性病理，但兩組中的雜合子缺失小鼠都沒有檢測到任何表型。由于BAG3相關的人類心臟疾病常常與雜合子功能缺失突變有關，因此小鼠可能無法作為該疾病的理想模型。

       BAG3是由熱休克因子1誘導的應激反應基因。雖然BAG3在許多組織中廣泛表達，但它在骨骼肌和心肌中表達zuigao，并定位于肌節(jié)Z線。作為一種輔助伴侶，BAG3蛋白調(diào)節(jié)ATP周轉以及HS70（組成型）和HSP70（誘導型）的蛋白質(zhì)折疊活性。它還在物理和功能上與一個單獨的伴侶蛋白家族——小熱休克蛋白（HSPB）相互作用，并充當連接HSP70與HSPB家族功能的支架。在人類細胞中，BAG 3-HSP70-HSPB復合物通過蛋白酶體和自噬途徑調(diào)節(jié)泛素化蛋白降解。然而實驗性研究是通過過表達和/或瞬時敲除手段，在具有不確定生理相關性的永生化細胞系中進行的，鑒于人BAG3突變引起的心臟特異性的病理，以及靶組織中蛋白質(zhì)的dute表達模式，如果能在心肌細胞中進行疾病建模，將是zuiyou用的。此外為避免因方法產(chǎn)生的虛假相互作用，操縱內(nèi)源基因為一個優(yōu)選方法。為評估BAG3在人心肌細胞生理和病理功能中的作用，研究人員還利用基因工程構建的人誘導多能干細胞（iPSCs）產(chǎn)生了一系列同基因的心肌細胞，以更準確地概括人心肌病的各個方面，以及保護心臟免受應激的機制。

結果

01-BAG3突變型iPS-CMs

       在iPSCs的細胞質(zhì)中檢測到BAG3蛋白，在iPSC源的心肌細胞（iPS-CMs）中，BAG3增加了約10倍，并在肌節(jié)Z線和細胞核周區(qū)富集。首先研究BAG3缺陷對心肌細胞的影響，利用基因工程改造內(nèi)源性BAG3基因座產(chǎn)生功能缺失突變，以模擬早期無義突變的影響，在BAG3基因的兩個不同位點產(chǎn)生了突變（圖1）。轉錄激活因子樣效應因子核酸酶（TALENs）分離出具有功能缺失突變的雜合和純合克隆，并以第二外顯子的兩個不同部分為目標，使用以(CRISPR)/Cas9為基礎的策略進行了聚類（圖1）。測序驗證每個工程突變系的基因型。結果證明所有基因修飾的iPSC系都保留了多能性生長和形態(tài)、正常核型、表達多能性標記，并能有效地分化為心肌細胞。

       正如預測的那樣，BAG3功能缺失突變使BAG3蛋白表達減少（圖1）。突變心肌細胞保持分化30天以上，細胞活力、形態(tài)或跳動沒有明顯異常，與出生時心臟形態(tài)正常的BAG3基因敲除鼠模型一致。根據(jù)人類臨床報告和動物研究，假設BAG3突變細胞會隨著時間的推移引發(fā)肌絲結構斷裂，特別是在肌節(jié)Z線位置。為檢查肌絲結構，將心肌細胞放在玻片上培養(yǎng)并以不同的時間間隔觀察，隨后固定并染色肌節(jié)Z線蛋白α-actin（ACTN 2）。研究發(fā)現(xiàn)，心肌細胞放到玻片上會繼續(xù)跳動，但7天或更長時間后，BAG3-/-心肌細胞的Z線結構發(fā)生了嚴重損壞（圖1）。使用5分制評分法對細胞肌節(jié)紊亂程度進行評分。與野生（WT）型細胞相比，BAG3突變細胞中肌絲發(fā)生顯著紊亂的比例增加，BAG3-/-細胞顯示出比BAG3+/-細胞更嚴重的表型趨勢。在不同靶向策略產(chǎn)生的品系之間觀察結果一致，表明該表型是由BAG3表達而不是靶外效應引起的。

圖1 基因組工程構建的BAG3同基因突變使iPS-CMs中肌節(jié)混亂。（A）BAG3基因示意圖。（B）iPS-CMs中BAG3蛋白的蛋白質(zhì)印跡。（C）免疫熒光染色和流式細胞術，抗體靶向iPS-CMs中的BAG3。（D）BAG3-/-型iPS-CMs組與WT對照組的病理學比較。（E）5分制評分量化肌節(jié)紊亂。

02-生理相關條件下iPS-CMs的收縮功能

       對于在標準組織培養(yǎng)表面上培養(yǎng)的心肌細胞，通常其顯示出的形態(tài)形狀和肌原纖維排列與正常組織中不同。為評估更多生理相關條件下的心肌細胞收縮功能，選擇在有特定的幾何形狀的微圖案化表面上，使用不同硬度的聚丙烯酰胺基質(zhì)培養(yǎng)心肌細胞，通過Plexithermo公司的HCells高通量的單細胞測試平臺測量不同機械條件下的收縮功能。將心肌細胞接種到長寬比為7:1的矩形模型上，基質(zhì)硬度模仿生理性（10 kPa）或病理性增加的（35 kPa）心肌硬度。過測量基質(zhì)中嵌入的熒光珠的位移來計算單個細胞的收縮力。當在模擬生理硬度的基質(zhì)上培養(yǎng)時，BAG3+/–和BAG3-/-心肌細胞的收縮力比WT心肌細胞小（圖2）。為評估肌原纖維結構并測量肌節(jié)縮短，使用LifeAct標記方法，發(fā)現(xiàn)與WT心肌細胞相比，BAG3+/–和BAG3 -/-心肌細胞都顯示出肌節(jié)縮短缺陷（圖2）。在模擬病理（35 kPa）基質(zhì)上的重復實驗發(fā)現(xiàn)，硬度變大也會導致整體收縮能力減弱以及肌節(jié)縮短。因此，BAG3功能的部分喪失損害了人心肌細胞的收縮性能，會肌原纖維結構和活性的破壞，表現(xiàn)出擴張型心肌病表型。

圖2 在微圖案化基質(zhì)上培養(yǎng)的iPS-CMs中，BAG3突變產(chǎn)生收縮缺陷。（A）收縮能力是根據(jù)測量的力和收縮速度計算的，收縮速度通過顯微測定基質(zhì)中熒光珠的運動產(chǎn)生的牽引力獲得。（B）在LifeAct標記的肌原纖維中測量肌節(jié)縮短。（C）圖案化的LifeAct標記細胞圖像和相關的表面牽引應力熱圖。

03-BAG3防止蛋白酶體抑制劑引發(fā)的心臟毒性

       已知BAG3通過蛋白酶體或自噬途徑參與靶向的泛素化蛋白降解。因此可以假設，蛋白酶體抑制劑會對BAG3共伴侶活性有缺陷的心肌細胞造成進一步損害。蛋白酶體抑制劑是用于癌癥治療的一類重要化合物，但對動物和人有一定心臟毒性。錄像研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體抑制劑bortezomib（bortezomib）和carfilzomib（carfilzomib）處理后，iPS-CMs收縮力呈劑量依賴性降低。而產(chǎn)生這種效應的藥物濃度正好在所報道的患者靜脈輸注后的血漿藥物濃度范圍內(nèi)。除去蛋白酶體抑制劑后，收縮力仍繼續(xù)下降，但幾天后恢復（zuigao劑量除外）。值得注意的是，bortezomib對收縮力的作用比carfilzomib更強、更持久。

用同樣的方法比較了bortezomib對WT型和BAG3突變型心肌細胞的影響。與WT對照組相比，0.1 μMbortezomib使BAG3突變型iPS-CMs收縮力顯著降低（圖3）。以相同濃度和持續(xù)時間用bortezomib處理生理硬度基質(zhì)上培養(yǎng)的心肌細胞發(fā)現(xiàn)，與WT型相比，BAG3突變型心肌細胞受bortezomib影響更大，收縮力下降更多，并且未能恢復收縮活性（圖3）。

圖3 BAG3是防止蛋白酶體抑制劑bortezomib引發(fā)的嚴重心臟毒性所需的。（A）自動攝影顯微鏡系統(tǒng)（Cellogy Pulse），用于連續(xù)測量bortezomib（0.1μM）處理前和處理后每24h，iPS-CMs的收縮能力。（B）將在模擬生理硬度（10kPa）基質(zhì)上培養(yǎng)的WT型和BAG3突變型iPS-CMs暴露于bortezomib（0.1 μM）48h，然后在RPMI/B27培養(yǎng)基中恢復3天測量各個個時間點的收縮力（C，D）用表達熒光融合蛋白ACTN2-mKate2的質(zhì)粒轉染iPS-CMs，標記Z線。通過延時顯微鏡對單個細胞進行基線成像，在DMSO（0.01%）或bortezomib（0.1 μM）處理后每24h成像。（E）使用5分制系統(tǒng)在每個時間點對單個細胞進行評分。

為確定由bortezomib引起的收縮能力下降是否源于肌絲結構破壞，表達了一種熒光標記的ACTN2來標記活細胞中的Z線。表達轉基因的細胞正常存活，并繼續(xù)正常收縮。延時熒光顯微發(fā)現(xiàn)bortezomib處理48h內(nèi)，肌原纖維結構出現(xiàn)缺陷（圖3C–E）。5分制評分系統(tǒng)量化中肌原纖維紊亂程度，可見bortezomib處理后，BAG3+/–和BAG3-/-心肌細胞顯示出比WT心肌細胞更嚴重的肌絲結構破壞（圖3E）。這些結果支持了BAG3突變體不能補償?shù)鞍酌阁w損傷誘導的蛋白毒性應激。

用WT型、BAG3突變型和MYBPC3突變型iPS-CMs進行了劑量反應分析，以檢查bortezomib和carfilzomib對收縮性和生存力的影響（圖4）。已知心肌疾病中經(jīng)常會出現(xiàn)心肌肌球蛋白結合蛋白C（MYBPC3）突變，并可能與BAG3伴侶復合物有相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，與WT細胞相比，BAG3+/–和BAG3-/-細胞中bortezomib和carfilzomib抑制收縮的EC50顯著降低，而MYBPC 3+/–細胞中EC50沒有降低（圖4）。研究認為這些對收縮性的影響并不單純是細胞死亡造成的，因為bortezomib僅在BAG3-/-細胞中對細胞活力有顯著影響，而carfilzomib在達到抑制收縮性的劑量下對細胞活力的影響非常小。為進一步證實藥物毒性的特異性，用心臟毒性hualiao藥物ameisu重復了這些試驗，沒有發(fā)現(xiàn)BAG3突變心肌細胞毒性增加的證據(jù)（圖4）。最后，對于每種藥物，WT型細胞中的EC50與患者靜脈輸注后報告的峰值血漿濃度非常接近，證實該分析在臨床相關劑量下是敏感的。

圖4 BAG3和蛋白酶體抑制劑之間相互作用的基因和藥理學特異性。WT型、BAG3突變型和MyBPC 3突變型iPS-CMs用（A）bortezomib、（B）carfilzomib、（C）ameisu以zhiding劑量處理。在藥物處理前和處理后48h測量收縮峰值高度。下圖為使用非線性回歸分析從每個相應的劑量反應曲線計算的EC50和95%置信區(qū)間。

04-BAG3敲除對伴侶蛋白的影響

假設BAG3基因敲除，會對參與協(xié)調(diào)應激反應的特定BAG3相互作用伴侶的表達有影響。而研究發(fā)現(xiàn)敲除BAG3會導致HSPB8蛋白水平降低，但其他伴侶不受影響（圖5A-C）。與在永生化細胞系中的發(fā)現(xiàn)一致，用bortezomib處理會顯著誘導BAG3和HSP70蛋白水平增加（圖5A和B）。MG132和carfilzomib也有類似效果。已知在報道的與BAG3相互作用的心臟富集型小熱休克蛋白（HSPB5-8）中，只有HSPB6和HSPB8在WT細胞中是由蛋白酶體抑制誘導的（圖5A和B）。此外bortezomib處理后，CRYAB（HSPB5）蛋白在BAG3-/-細胞中特異性積累（圖5A和C）。

結果表明HSPB8是心肌細胞BAG3功能的一個特別重要的伙伴。有研究報告稱，激活自噬降解蛋白毒性肽需要BAG3和HSPB8。因此假設BAG3表達喪失的同時蛋白酶體抑制，將損害心肌細胞調(diào)節(jié)自噬的能力，而自噬控制泛素化蛋白質(zhì)的補償性降解。為測量自噬通量，使用蛋白質(zhì)印跡法監(jiān)測巴非霉素A1（抑制自噬降解）對LC3蛋白水平的影響。發(fā)現(xiàn)巴非霉素A1處理后，LC3-II快速降解增加了4-6倍，與心肌細胞中活躍的自噬通量一致（圖5D和E）。額外使用bortezomib處理使LC3-II水平顯著增加，與自噬的補償性誘導一致（圖5D和E）。然而BAG3敲除的雜合或純合體在任何條件下都不會顯著改變LC3-II的水平。此外在WT和BAG3缺陷型心肌細胞中，bortezomib處理后泛素化蛋白的積累是相同的（圖5D）。這些發(fā)現(xiàn)表明在人心肌細胞蛋白酶體抑制引發(fā)的大量自噬通量應答中，BAG3并不是調(diào)節(jié)該應答所必需的，但并不排除BAG3可能靶向其中的客戶蛋白。

圖5 bortezomib誘導心臟伴侶應激反應并增加自噬流量，后者不需要BAG3。（A）iPS-CMs用載體對照或1μMbortezomib處理20h，然后提蛋白進行WB。（B和C）條帶強度根據(jù)GAPDH量化，并根據(jù)載體處理對照標準化。B為分別用載體和bortezomib處理的WT心肌細胞，C為分別用載體和bortezomib處理的BAG3-/-心肌細胞。（D）iPS-CMs分別用DMSO、100 nM巴非霉素A1（BafA1）處理6h，或1μMbortezomib處理14h后100 nM巴非霉素A1處理6h。提取總蛋白，抗LC3A/B抗體進行WB。（E）LC3-II帶強度根據(jù)GAPDH量化，根據(jù)對照樣品標準化。

05-與BAG3蛋白相互作用的心臟特異性成分

為確定BAG3伴侶復合物的心臟特異性成分和/或客戶蛋白，進行了AP-MS。使用基因組工程將一個C末端3×FLAG親和標簽敲入兩個等位基因的內(nèi)源性BAG3位點。當用HSP70進行體外分析以評估核苷酸交換因子活性和客戶蛋白釋放時，N端和C端BAG3-FLAG與WT BAG3間沒有差異。bortezomib處理WT和BAG3-FLAG iPS-CMs，發(fā)現(xiàn)暴露48h后收縮力沒有差異。AP-MS分析發(fā)現(xiàn)，在iPS-CMs中共鑒定出46種與內(nèi)源性BAG3-FLAG的高置信度相互作用（圖6）。伴侶蛋白和相關蛋白質(zhì)構成了其中zuida的一組相互作用因子，支持了前文假設即BAG3調(diào)節(jié)心臟中的蛋白質(zhì)質(zhì)量控制途徑。相互作用網(wǎng)絡沒有觀察到任何與自噬直接相關的蛋白質(zhì)，與BAG3在調(diào)節(jié)LC3通量方面缺乏作用一致。從未分化的iPSCs和iPS-CMs中鑒定的相互作用因子中，普遍表達的伴侶蛋白及其相關蛋白大部分重疊。僅從具有內(nèi)源性BAG3標簽的心肌細胞中鑒定出額外的伴侶相關蛋白，包括HSPB8和CRYAB，而心肌細胞中表達的其他小熱休克蛋白則不存在，包括HSPB6和HSPB7。此外一些核糖體和其他RNA結合蛋白也被鑒定為心臟特異性的BAG3復合物的一部分，這可能代表了蛋白質(zhì)質(zhì)量控制的一個未被充分認識的方面。其余鑒定出的相互作用因子是各種細胞質(zhì)、肌節(jié)、細胞核和分泌蛋白，它們可能是BAG3伴侶復合物的靶標，或者它們暗示了與其他細胞功能的聯(lián)系。

圖6 心臟特異性BAG3蛋白相互作用網(wǎng)絡。在具有內(nèi)源性BAG3-3×FLAG標記的iPS-CMs中，通過AP-MS鑒定出的所有46個相互作用因子按功能類別分組。白色圓圈表示也從未分化的iPSCs中鑒定出的相互作用因子，紅色圓圈僅從iPS-CMs中鑒定出的。

結論

本研究建立的細胞模型允許在單個同基因背景下直接比較不同的突變，模擬BAG3功能遺傳損失發(fā)現(xiàn)雜合BAG3突變導致BAG3蛋白減少約50%，并在人類心肌細胞中產(chǎn)生人類疾病表型。一些試驗中BAG3功能部分和*喪失同樣損害心肌細胞的生理功能，表明嚴格調(diào)節(jié)BAG3表達水平的重要性。蛋白酶體抑制劑bortezomib或carfilzomib處理后，即使BAG3功能部分喪失也會導致收縮功能和肌絲完整性的嚴重失代償，證實了BAG3共伴侶功能可防止蛋白毒性應激。

本研究還利用AP-MS鑒定了HSP70和小HSP家族中，與心肌細胞BAG3相互作用的特定蛋白質(zhì)。證明了內(nèi)源性表位標簽能夠幫助在感興趣的細胞類型的生理表達水平上研究蛋白質(zhì)相互作用。并通過這種方法鑒定了幾種潛在的新型BAG3相互作用蛋白，包括突變會導致包涵體肌病的VCP、常突變于肥厚型和擴張型心肌病中的MYBPC3，其中MYBPC3是weiyi與BAG3復合物結合的肌節(jié)蛋白，表明它可能是一種重要的客戶蛋白。其他蛋白表明BAG3可能在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)組中發(fā)揮額外功能，如在核糖體翻譯水平上。未來對這些途徑的基因和功能研究可能會幫助揭示心力衰竭的機制、藥物毒性的遺傳易感性，推進新治療策略的開發(fā)。

參考文獻：

Luke, et al. "A BAG3 chaperone complex maintains cardiomyocyte function during proteotoxic stress." JCI Insight 2.14(2017).

高通量單細胞功能檢測系統(tǒng)

在以上研究中，涉及了一種高通量的單細胞測試平臺，它可以對多個hPSC-CMs單細胞進行成像與力學測試。現(xiàn)為大家介紹Plexithermo公司的HCells高通量單細胞功能檢測系統(tǒng)(HCells-1基本型，HCells-1F離子測量型）。作為一種非破壞性，非侵入性的細胞檢測平臺，它可以對多個細胞進行快速成像，同時可得到細胞的收縮力、鈣瞬變、收縮速度、細胞大小、面積、實際功率，收縮角度、速度差和力差等大量數(shù)據(jù)。所搭載的納米水凝膠的可調(diào)控基底硬度，對培養(yǎng)的心肌細胞進行催熟并促進分化以適應不同的研究需求。此外，該平臺支持宏觀尺度下的功能檢測，包括各種組織、斑馬魚模型等，應用前景十分廣闊。