心臟病仍是quanshijie范圍內死亡的主要原因。當遭受心臟疾病時，心肌細胞（CMs）會被瘀痕組織替換，瘀痕組織不能完成收縮，因此不能參與泵血，導致剩余健康心肌組織壓力增大，最終導致心力衰竭。在低等脊椎動物如蠑螈和斑馬魚中，心肌細胞能夠高效的再生受損心臟。但是，在哺乳動物中，有絲分裂后的成熟心肌細胞對受損組織的修復能力有限，再生和修復損傷能力只能持續到出生的時候，此后，這種能力便會yongjiu消失。有趣的是，在新生小鼠中，心肌細胞增殖在出生一周之內足以修復心臟損傷，這一周的時間可以給科學家提供一個時間窗口來探究促進心臟再生的線索。

       今天，與大家分享一篇2017年由以色列威茲曼科學研究院的Eldad Tahzor 教授發表在Nature（IF=40.137）上的文章《The extracellular matrix protein Agrin promotes heart regenerationin mice》，作者發現新生小鼠心臟中的聚集蛋白(Agrin)似乎可以控制心肌細胞的再生過程。當將其注射到遭受心臟病發作的成年小鼠心臟中時，Agrin可以開啟心肌細胞再生功能，修復受損心肌細胞。

圖1 小鼠心臟ECM介導的CMs增殖中Agrin的篩選鑒定

       首先，為了研究細胞外基質（ECM）在心臟再生中的作用，作者選取新生小鼠（P1）和一周大（P7）的小鼠的ECM開展實驗：將ECM中的細胞去除，僅留下基質，將其分別加入到體外培養的心肌細胞中，對心肌細胞Ki67指標進行檢測。得出新生小鼠的ECM更容易使心肌細胞增殖（圖1  a-d），且以MMP依賴的方式進行誘導（圖1  e-h）。通過質譜方法確定新生小鼠（P1）和一周大（P7）的小鼠的ECM中主要區別成分為Agrin，這種物質促進心肌細胞增殖。通過RNA、Western  blot和免疫熒光分析進一步驗證了新生小鼠（P1）ECM中Agrin含量更高（圖1  i-k）。另外，還通過實驗證明了Agrin可以在體外促進CM增殖（圖1l）。

圖2 Agrin延緩新生小鼠CMs成熟，是新生小鼠手術切除后心臟再生所必需的

       通過雜交手段，構建Agrin基因缺失的小鼠cKO（圖2a）。對Agrin-cKO小鼠心臟中Agrin蛋白和mRNA表達的分析證實了等位基因被有效地刪除（圖2b-d）。Agrin-cKO-CMs的肌節結構表現出更成熟的狀態，肌節α-肌動蛋白和T-小管標記物定位效果增強（圖2e）。同樣，在Agrin-cKO心臟中，通過western  blot（圖2f）和線粒體標記物Tom20（圖2g）染色對Myh6/Myh7比率的量化顯著提高。P1  Agrin-cKO心臟切片顯示橫紋肌節染色增加，CMs細胞周期活性降低（圖2h，i）。這些現象表明，Agrin在新生小鼠期會起到抑制CM成熟的作用（圖2e-g）

       最后，檢測Agrin-cKO小鼠心臟再生是否受損。P1小鼠接受心臟切除術，并在1周和4周后進行評估（擴展數據圖5i）。采用Masson三色染色的組織學檢查顯示，相對于野生型小鼠，Agrin-cKO小鼠的纖維化程度升高（圖2j-l），與心功能降低一致（圖2m，n）。相應地，在Agrin-cKO心臟，CMs增殖減少（圖2o，p）。綜上所述，這些結果表明Agrin對于新生小鼠心臟再生是必要的，但對于出生后心臟的生長和維持并不是嚴格要求的。

圖3 Agrin誘導成年小鼠心臟再生

       接著研究了重組Agrin是否能促進成年小鼠CMs的增殖和心臟再生（圖3）。單次向心肌內注射Agrin（50μL,20μg/mL），PBS作為對照。Agrin處理可誘導鄰近于幼年心臟和成年心臟梗死區健康心肌中的CMs重新進入細胞周期（圖3a-c）。心肌梗死后4天的成年小鼠心臟組織學分析顯示，兩組受損區域相似，但從第14天開始，Agrin處理心臟瘢痕組織面積減少，到第35天顯著減少（圖3d、e）。此外，Agrin處理可以改善心肌梗死后的心功能，這兩種模型的超聲心動圖都很明顯（圖3f、g）。與對照組相比，Agrin處理的小鼠還表現出壁厚的保留和對擴張型心肌病的保護作用（圖3h）。

圖4 Agrin通過Dag1、ERK和Yap信號轉導促進CM增殖

       Dag1在P1心臟中廣泛表達，然而到P8，其mRNA和蛋白質的表達jinxian于CMs（圖4a-c）。Agrin處理后在P7心肌細胞培養中觀察到短暫的ERK激活（圖4d）。添加IIH6C4（一種針對Dag1-Agrin結合位點的阻斷抗體）降低了Agrin誘導的ERK激活（圖4e）。此外，使用PD0325901（PD，MEK抑制劑）或抗Dag1抗體（圖4f，g）阻斷Agrin誘導的p7   CM增殖。在P7培養的CMs中，Agrin誘導的肌節分解（擴展數據圖8d）與Agrin治療后*失去心肌肌鈣蛋白T表達的CMs數量增加2.5倍一致（圖4j）。Dag1能夠與Dystrophin結合形成糖營養不良蛋白復合物（Dystrophin-glycoprotein   complex，DGC）。為了研究Agrin-DGC與信號分子Yap之間的聯系，用抗Syntorphin抗體對免疫沉淀DGC蛋白進行了實驗，并對復合物和Yap進行了印跡。DGC組分的Co-IP證實Agrin和Yap都會與DGC結合（圖4k-l）。經過Agrin處理后，CMs中核Yap的百分比增加了3-4倍（圖4m）。并且，Agrin在Verteporfin（Yap-TEAD轉錄活性抑制劑）存在下未能誘導CM增殖（圖4n）。這一結果暗示了在Agrin誘導的CM增殖過程中Yap相關的信號機制。綜上所述，生化分析表明，Agrin通過Dag1與DGC結合并降低其穩定性，隨后導致肌原纖維分解和下游信號分子（包括Yap和ERK）的激活。

圖5 Agrin促進hiPSC-CMs增殖并減弱其成熟

       研究Agrin能否促進人誘導的多能干細胞（hiPSC-CMs）在明膠涂層2D基質上的增殖。人或大鼠細胞活性周期與Agrin呈現濃度依賴性關系（圖5a，b）。為了探討Agrin是否能抑制hiPSC-CMs的成熟過程，采用3D貼片培養系統，分析了Agrin對hiPSC-CMs增殖和結構和功能成熟的影響。長時間給藥處理（100   ng/ml，兩周）可促進CMs周期活性增加2倍（圖5c）。此外，Agrin處理的CMs表現出成熟延遲，主要表現為傳導速度降低（圖5d），一系列功能性和成熟性標記的表達顯著降低（圖5e，f）。綜上所述，與對小鼠的研究結果一致，Agrin促進了hiPSC-CMs在二維和三維培養系統中的增殖并減弱其成熟。

總結

       文章揭示了Agrin作為新生小鼠ECM的一個重要組成部分，是新生小鼠心臟再生bukequeshao的成分。在體外，重組的Agrin分解DGC，并通過Yap和ERK介導的信號途徑，誘導促進小鼠和人類多功能干細胞重新分化出心肌細胞。通過單次皮下注射Agrin到小鼠體內，也可以促進心肌梗死的成年小鼠的心臟再生。同時，Agrin也可以促進了hiPSC-CMs在二維和三維培養系統中的增殖并減弱其成熟。盡管該模型中觀察到的CMs增殖程度表明還會有其他的作用機制，但這項研究結果得出ECM的成分可以促進心臟的修復，其中Agrin處理顯示出作為一種相對安全有效的修復哺乳動物受損心臟的藥物的潛力。Agrin的發現將有助于CMs再生生物醫學進一步的研究。

       在該研究中，細胞成像技術在hiPSC-CMs的組織學分析中起到了至關重要的作用，一臺能夠迅速對多孔位細胞樣品進行快速高通量測試的儀器可讓研究工作達到事半功倍的效果。

       來自英國Plexithermo的HCells高通量單細胞、器官功能測量及納米水凝膠3D培養系統：可針對單個細胞形態、細胞張縮力、張縮速度、張縮功率、離子濃度變化、細胞運動軌跡，方向和頻率，以及速度或距離量化等進行批量測量，達到每小時300個以上單細胞的數據采集，真正實現高通量單細胞采集。

       采集數據包括多種單細胞力學指標：測細胞收縮的速度和細胞力度、細胞大小、面積、真正產生的功率，收縮時的角度x軸y軸，產生的速度差和力差等。此系統的全自動設計，測試一輪后，可以定位回到同一個細胞重復測量細胞的狀態或者不同的處理。可以長期培養后，不同時間對同一個細胞進行測試。測量對象可以是貼壁細胞，如成年大鼠，成年小鼠，人源干細胞。高通量單細胞功能檢測系統能夠從細胞微觀水平到組織宏觀水平評估各種各樣的運動范圍、細胞運動軌跡、單個細胞力、硬度及離子濃度，如一個孔內一個小時測300個以上單細胞的收縮和離子濃度快速變化。

1、心肌細胞

采用超速成像納米水凝膠技術。保證藥物一定濃度水平下批量測心肌細胞的力學指標和離子濃度變化。測細胞收縮的速度和細胞力度、細胞大小、面積、真正產生的功率，收縮時的角度x軸y軸，產生的速度差和力差等，并且可以模擬器官硬度。通過軌跡分析選擇跟蹤區域和運動方向。軟件對遷移單元的速度或距離進行量化。可以分析細胞運動的頻率。細胞跟蹤檢測軌跡并提供定量數據跟蹤功能還可以分析面積、周長和圓度等參數，使軟件能夠跟蹤形狀變化，例如體外心肌細胞。

2、細胞遷移和精子運動軌跡

跟蹤函數檢測細胞軌跡，并可以計算定量數據，例如：作為軌跡（xy圖表），距離和速度。這使得系統具有檢測和測量功能，例如細胞遷移和精子運動的軌跡。

3、動態跟蹤可以分析細胞增殖的變化，如菌落形成。

4、人iPS細胞衍生神經細胞的細胞活力測定：

可以測量神經元的運動。神經元運動的功率譜密度（PSD）可用于準確預測細胞死亡。PSD表示一個單元在頻域中的運動強度。神經元培養的PSD比傳統的生存能力測量更精確地預測細胞死亡。

5、核跟蹤特征可用于分析癌細胞遷移。

測量對象：癌細胞、斑馬魚、精子、菌落、貼壁細胞（如：急性分離的成年小鼠細胞，乳鼠細胞、成年大鼠的心肌細胞、骨骼肌細胞、

參考文獻:

Elad  Bassat, Yara EidMutlak, Alex Genzelinakh et al. The extracellular  matrix protein Agrin promotesheart regeneration in mice. Nature,  Published online 05 June 2017,doi:10.1038/nature22978