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非洲豬瘟核酸病毒*[風途基礎講解]

來源:山東風途物聯網科技有限公司   2021年07月14日 11:31  

  非洲豬瘟核酸病毒*FT-ZWSJ2風途試劑基礎介紹Африканын чочко ыла?ы нуклеин кислотасынын вирусун ДНК б?л?п алуу ?ч?н топтом對于當前的非洲豬瘟疫情豬場主要措施就是預防;非瘟清,主要用于防治豬的病毒性傳染病(瘟疫病,如非洲豬瘟、藍耳、圓環、流感等)用于非洲豬瘟、藍耳、圓環、鏈球菌、流感、附紅體、弓形體及混感等引起的豬發熱性(瘟熱性)疾病的治療與預防。癥見:高熱神昏、精神萎頓、結膜潮紅、充血;皮膚發紅,體表出血、瘀血,四肢、下腹、會陰、臀等位尤其嚴重;咳嗽、喘氣、呼吸困難;嘔吐,食欲減退或廢絕,糞便干硬、便秘或排膿性血便;母豬伴有不孕、流產、死胎。剖檢病死豬可見脾臟、肝臟、肺臟等臟器和淋巴結嚴重腫大,并廣泛性出血瘀血。本病急性發病時死亡率很高,尤其是母豬、大豬死亡更快。非洲豬瘟核酸病毒*

  【獸藥名稱】

  通用名稱:非洲豬瘟病毒熒光PCR核酸檢測試劑盒

  漢語拼音:Feizliouzhuwen Bingdu Yingguang PCR Hesuan Jianceshijihe

  英文名稱:African swine Fever Virus (ASFV) PCR Nucleic Acid Diagnostic Kit

  商品名稱:無

  【主要成分與含量】試劑盒中含有如下組分:

試劑盒中含有如下組分:

試劑盒組分

含量

陽性對照

250μL/管×1管

 

陰性對照

250μL/管×1管

 

PCR反應液

850μL/管×1管

 

萌混合液

150μL/管×1管

 

說明書

1份/盒

【作用與用途】 本試劑盒可用于血液、脾臟、肝臟、淋巴結、 樣品中非洲豬瘟病毒核酸的檢測。

扁桃體、腎臟、肌肉、環境樣品等

  【用法與判定】

  1 用法

  1.1待檢樣品釆集、保存及運輸

  1.1.1樣品釆集

  (1) 活豬樣品 無菌采集抗凝血或血清5mL

  (2) 病死豬剖檢樣品或屠宰場剖檢樣品 無菌采集死豬的牌、肺、腎、扁桃體、淋巴結、肌肉等組織樣品。2?8°C低溫運至實驗室用于檢測。

  (3) 病豬污染的周邊環境 采集與病豬相關場所的糞便、飼料、污水樣品。2?8°C低溫運至實驗室用于檢測。

  1.1.2樣品保存 采集的樣品在2?8°C保存應不超過24小時,-70°C條件下保存,避免反復凍 融。

  1.1.3樣品運輸泡沫箱加冰袋后密封進行運輸。包裝和運輸應符合《高致病性動 物病原微生物菌(毒)種或者樣品運輸包裝規范》和運輸門關于危險品運輸管理的有關規定。

  1.2樣品處理

  1.2.1血液樣品處理 抗凝血樣品置于離心管中,8000 r/min離心2分鐘取上層血漿,編號待 檢。非抗凝血樣品置于離心管中,待凝固后,8000 r/min離心2分鐘取200μL上層血清,編號待檢。

  1.2.2組織樣品處理取適量脾臟、肝臟、淋巴結、扁桃體、肌肉等組織,置于研磨器或研磨管中研磨,再加適量生理鹽水混勻,制成約10%的組織勻漿,8000 r/min離心2分鐘,取200μL上 清于RNase/DNase-free無菌離心管中,編號備用。

  1.2.3環境樣品處理

  1.2.3.1糞便、飼料樣品處理方法取適量的糞便、飼料放入盛有PBS緩沖液的研磨管中研磨混勻,制成約10%的勻漿液.8000 r/min離心2分鐘,取200μL上清于RNase/DNase-free無菌離心 管中,編號備用。

  1.2.3.2污水樣品處理方法 直接取200μL污水進行核酸提取。

  1.3病毒核酸的提取用磁珠法或柱式法進行DNA核酸提取。

  1.4熒光PCR反應:

  1.4.1從試劑盒中取出熒光PCR反應液、酶混合液,室溫融化后,2000 r/min離心5秒。設被 檢樣品、陽性對照和陰性對照總和為n,則反應體系配制如下:

  試劑 體系

  PCR 反應液 17× (n+1) μL

  酶混合液 3× (n+1) μL

  1.4.2在新的RNase/DNase-fire 1.5 ml離心管中加入上述試劑,充分混勻后瞬時離心。按照20μL/ 管分裝量將試劑分裝至熒光PCR反應管。

  1.4.3在上述制備好的熒光PCR反應管中分別加入陰性對照、陽性對照各5μL、處理好的待測核酸各5μL,終體積25μL/管,蓋好熒光PCR反應管蓋,混勻后瞬時離心,轉移到熒光PCR儀器 上。

  144將PCR反應管放置在熒光PCR儀樣品槽中,在熒光PCR儀上運行以下程序:

步驟

條件

循環數

UNG處理

50 ℃2分鐘

1

預變性

95 ℃3分鐘

1

預擴增

95 ℃: 8 秒 55 ℃: 8 秒

 

5

PCR擴増

95 ℃: 8 秒 55 ℃: 8 秒

 

40

  熒光通道選擇FAM,在PCR擴增階段每個循環的55℃時采集熒光信號。設置擴增體系為25μL, 同時要選擇passive reference和quencher為none的模式。(注:若熒光PCR儀(如AB17500)按說明 書中的反應程序設置后因持溫時間短無法運行,可將預擴增和PCR擴增條件變更為95C: 5秒 55°C: 30 秒)

  2結果判定

  2.1試驗有效性判定

  陽性對照有典型擴增曲線且Ct值≤30.且陰性對照無Cl值或無擴增曲線,線形為直線或輕微斜線,無指數增長期。則判試驗結果有效。否則,此次試驗視為無效。

  2.2樣品判定

  2.2.1陽性:樣本檢測結果Ct值≤35且有明顯指數增長期,判定檢出非洲豬瘟病毒核酸。

  2.2.2可疑:樣本檢測結果Ct值在35?38范圍內。此時應對樣本進行重復檢測,如果重復實驗 結果Ct值仍在35?38范圍內,有明顯指數增長期.則判定為陽性,否則為陰性。

  2.2.3陰性:樣本檢測結果Ct值>38或無Ct值,判定未檢出非洲豬瘟病毒核酸。

  【注意事項】(1)實驗前請仔細閱讀本試劑盒說明書,嚴格按照操作步驟執行,在操作過 程中對時間、試劑體積等精確控制可以獲得好的結果。

  (2) 實驗室應嚴格按照有關規定分區管理,依照配液區-模板提取區-擴增區-分析區順序 進行基因檢測。各區間人員、器材、試劑及空氣流向應有嚴格要求。

  (3) 核酸提取有關耗村確保潔凈、無DNase/RNase,提取過程盡量低溫、快速,完成后進入 下一步實驗或凍保。

  (4) 對于頂采光儀器要帶新的一次性PE手套對熒光PCR管封蓋,對于底采光儀

  器要避免徒手或使用過的手套接觸熒光PCR管底,檢測過程中使用不帶熒光物質一次性乳膠手套。

  (5) 凍存試劑使用前應于室溫下*融化,瞬時離心使液體*沉于管底。避免反復凍融, 以免影響試劑性能。

  (6) 樣品、陽性對照等在使用后及時封蓋,.避免組分間及氣溶膠等的污染造成假陽性。

  (7) 擴增產物禁止開蓋,實驗產生的廢棄物應及時收集,遠離PCR實驗室進行無害化處理。

  【規格】50頭份/盒

  【貯藏與有效期】試劑盒置-20°C以下避光保存,有效期12個月。

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