間接法成功的關鍵在于抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果，但應盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。特別應注意除去能與一般健康人血清發生反應的雜質，例如以  E.Coli  為工程酶的重組抗原，如其中含有 E.Coli  成份，很可能與受過 E.Coli 感染者血甭中的抗 E.Coli  抗體發生反應?？乖幸膊荒芎信c酶標抗人 Ig  反應的物質，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的 Ig去除，試驗中也發生假陽性反應。另外如抗原中含有無關蛋白，也會因竟爭吸附而影響包被效果。

  間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。病人血清中受檢的特異性  IgG  只占總 IgG  中的一小部分。IgG  的吸附性很強，非特異 IgG  可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被后一般用無關蛋白質（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空余間隙。另外，在檢測過程中標本須先行稀釋（1:40~1:200），以避免過高的陰性本底影響結果的判斷。