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細(xì)胞培養(yǎng)中污染的預(yù)防與清除

來源:上海銳聰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司   2010年09月13日 17:14  

預(yù)防是防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染的辦法。只有預(yù)防工作做在前,才能將發(fā)生污染的可能性降到zui小程度。一般預(yù)防可從以下幾方面著手:

(一)從操作者做起
1、操作者責(zé)任心要強(qiáng),要細(xì)心穩(wěn)重,操作技術(shù)要熟練。進(jìn)無菌室前要用肥皂洗手或用5%新潔爾滅浸泡5分鐘,按規(guī)定穿*。進(jìn)入后關(guān)好門,坐下來盡量少走動。工作開始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。事先要嚴(yán)格檢查器材、溶液和培養(yǎng)物,不要把污染品或未經(jīng)消毒的物品帶入無菌室內(nèi),更不能隨便使用,以免造成大批污染。
2、操作者動作要輕,必須在火焰周圍無菌區(qū)內(nèi)打開瓶口,并將瓶口轉(zhuǎn)動燒灼。操作時盡量不要談話,若打噴嚏或咳嗽應(yīng)轉(zhuǎn)向背面。
3、操作時要常更換吸管,切勿一根吸管做到底。一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應(yīng)棄去。實(shí)驗(yàn)完畢及時收拾,保持實(shí)驗(yàn)室清潔整齊,zui后用消毒水浸泡的紗布擦臺面。

(二)從物品、用品消毒滅菌著手
細(xì)胞培養(yǎng)所用物品清洗、消毒要*,各種溶液滅菌除菌要仔細(xì),并在無菌試驗(yàn)陰性后才能使用。操作室及剩余的無菌器材要定期清潔消毒滅菌。

(三)防止細(xì)胞交叉污染
在進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)操作時,所用器具要嚴(yán)格區(qū)分,做上標(biāo)記便于辨別。并按順序進(jìn)行操作,避免一起進(jìn)行時易發(fā)生混亂。
在進(jìn)行換液或傳代操作時,注射器和滴管不要觸及細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶口,以免把細(xì)胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細(xì)胞。
所有細(xì)胞一旦購置,或從別處引入,或自己建立,均應(yīng)及早留種凍存,一旦發(fā)生污染可棄之復(fù)蘇,重新培養(yǎng)。

二、污染的清除
培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)污染,多數(shù)較難處理。如果污染細(xì)胞價值不大,宜棄之;有細(xì)胞株留存的或可購置的,可在尋找原因后*消毒操作室,復(fù)蘇或重新購置細(xì)胞,再培養(yǎng)。若污染細(xì)胞價值較大,又難于重新得到,可采取以下辦法清除。

(一)使用抗生素
抗生素對殺滅細(xì)菌較有效。聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥效果好。預(yù)防用藥比污染后再用藥效果好。預(yù)防用藥一般用雙抗生素(*100u/mL加*100μg/mL),污染后清除用藥需采用大于常用量5~10倍的沖洗法,于加藥后作用24~48小時,再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期可能有效。所用抗生素品種除*、*外,還可用*、*、多粘菌素、四環(huán)素、*等。常用400~800μg/mL*或200μg/mL四環(huán)素處理,每隔2~3日換液1次,傳1~2代進(jìn)行治療。近年來有報(bào)道,4-氟,2-羥基喹啉(Ciprofloxacin,Cip)、截耳素衍生物(Pleu-romutilinderivative,BM-Cyclin2:BM-1和四環(huán)素衍生物(BM-2)等三種抗生素單用或合用對殺滅支原體有效。這三種抗生素均用PBS配成250X濃縮液,-20℃保存?zhèn)溆?,使用濃度Cip為10μg/mL,BM-1為10μg/mL,BM-2為5μg/mL。使用時先吸除污染的培養(yǎng)液,加入含BM-1的RPMI1640培養(yǎng)液,3天后再吸除培養(yǎng)液,加入含BM-2的RPMI1640培養(yǎng)液,培養(yǎng)4天,如此連續(xù)3個輪次,直至用33258熒光染色鏡檢證明已清除支原體后,再加正常培養(yǎng)液培養(yǎng)傳代3-4次。

(二)使用支原體特異性血清
用5%的兔支原體免疫血清(血凝效價1:320以上)可去除支原體污染,因特異抗體可抑制支原體生長,故經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性,并且5個月后仍為陰性。但此法比較麻煩,不如用抗生素方便、經(jīng)濟(jì)。

(三)加溫處理
將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時,可殺死支原體,但對細(xì)胞有不良影響。所以在處理前要進(jìn)行預(yù)試驗(yàn),摸索能zui大限度殺死支原體又對細(xì)胞影響zui小的加熱時間。此法有時不可靠。若先用藥物處理后,再以41℃加溫處理效果更佳。

(四)其他方法
除了上述去除污染的方法外,還有動物體內(nèi)接種除菌法、巨噬細(xì)胞吞噬法、污染培養(yǎng)瓶中加溴*再用光照射的方法及過濾法等,但均較麻煩,且效果不確定。所以一旦支原體污染,除非有特別重要價值,一般均棄之重新培養(yǎng)。

 

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