分離效率和靈敏度較差，保守的分析方法的干擾因素較多。而采用的此法可在5min內同時測定糖尿病腎病尿樣中的CnCrU和Ua這4種非蛋白氮代謝產物.此方法具有快速、需樣量小、靈敏度高和重現性好的特點，*可運用于臨床上患者尿液的日常分析和早期腎病的監測。

流動相含30％（體積比）甲醇和10mmol/LpH6.86磷酸緩沖溶液，摘要】目的建立糖尿病患者尿液中與腎病相關的非蛋白氮代謝產物（肌酸、肌酐、尿素和尿酸）反相液相色譜分離分析方法.方法：采用AgilentC18200mm4.6mm內徑5μm色譜柱。流速0.9mL/min檢測波長200nm柱溫為室溫.結果：5min內可對患者尿液中上述4種物質同時進行測定，樣品前處理簡單，重現性較好（遷移時間和峰面積的RSD均≤3%線性范圍較寬（肌酸：5~300μmol/L肌酐：10~200μmol/L尿素：1~30mmol/L尿酸：10~1500μmol/L.結論：此法*適用于臨床上患者尿液的日常分析和早期腎病的監測。

關鍵詞】反相液相色譜；糖尿病腎??；非蛋白氮；尿樣

引言

已引起了人們廣泛關注.非蛋白氮代謝產物如肌酸（creatinCr肌酐（creatininCn尿素（ureaU和尿酸（uricacidUa即是與DN相關的幾種物質.已報道的有關這些物質的分離分析方法主要有比色法［1］、酶法［2］、液相色譜法［3-6］、毛細管電泳法［7-9］等.其中比色法和酶法通常只能測定單一的物質，糖尿病并發腎?。╠iabeticnephropathiDN糖尿病患者致死的重要原因之一。而且尿液中的一些內源性物質對測定有干擾；液相色譜法則多集中在對某一種或部分物質的測定上；毛細管電泳測定這些標志物重現性有待于提高.運用反相液相色譜法，對DN患者尿液中與DN相關的CrCnU和Ua這4種非蛋白氮代謝產物進行同時分離檢測.同時測定尿液中的4種物質目前還未見報道.此法具有快速、靈敏度高和重現性好的特點，*可運用于臨床上患者尿液的日常分析和早期腎病的監測.

1資料和方法

水為二次重蒸水1.1資料Agilent1100液相色譜儀（美國Agilent公司）CrCnUa均購自Sigma公司（USASigma甲醇為色譜純試劑（天津第二化學試劑廠）其余試劑均為分析純。.

1.2方法

等度洗脫，1.2.1色譜條件色譜柱為AgilentC18柱（200mm4.6mm內徑5μm流動相含體積比為30%甲醇和10mmol/LpH6.86磷酸緩沖溶液。流速0.9mL/min檢測波長200nm柱溫為室溫，進樣量為10μL.

溶解在40mL重蒸水中，1.2.2規范溶液的配置和尿樣的處置方法CrCn和U規范溶液均使用二次重蒸水配置成一定的濃度.Ua溶液的配置方法如下：取30mg磷酸鉀。加熱至60℃，使其*溶解，稱取Ua28mg溶解于熱磷酸鉀溶液中，冷卻至室溫，移入100mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，貯存在棕色瓶中保存.尿液樣品的處置方法：取新鮮的尿液用水稀釋1倍后待用.所有溶液每周更換1次，使用前均過0.45μm水相膜后再用于色譜分析.

2結果

分別改變緩沖液的pH值、流動相（pH6.86中甲醇比例、流動相中緩沖液濃度和流動相的流速，2.1色譜條件的優化固定其它色譜條件不變?？疾炝似鋵?種物質分離的影響。

連續5次測定了同一樣品，2.2方法重現性在選定的色譜條件下。對各物質的遷移時間、峰面積和峰高的重現性進行了考察，結果標明，各物質的遷移時間的變化很?。ū９軙r間的RSD值見表1方法的重現性較好。

按上述色譜條件進行分析測定，2.3定量規范曲線、回收率以及zui低檢測限配置一系列濃度的規范溶液。將所測的峰面積對物質的濃度作回歸分析，其線性相關系數均大于0.9992以信噪比（S/N為3來測定檢測限；

對規范溶液和實際DN尿樣進行了分析，2.4樣品分析在選定的色譜條件下。5min內4種物質即可達到*分離，分離結果如圖3所示，實際DN尿樣中的4種物質得到很好的檢出，尿樣里的其他物質對分析無干擾.采用此法對某糖尿病患者以及正常人尿樣中的CnCrUUa分別進行測定，結果糖尿病患者尿樣中CnCrUUa含量分別為10.30.6826.72.1μmol/mL正常人尿樣中的CnUUa含量分別為7.736.71.0μmol/mL而Cr未被檢出。

3討論

pH3.5~7.5范圍內U和Cr出峰時間和順序幾乎不隨pH變化而變化；而對于Cn和Ua來說，3.1pH對分離的影響其從圖1A中可以看出。其出峰時間和順序都隨pH變化而變化，當pH接近5.5時，兩者的出峰時間近乎相同，得不到分離.因此，選擇*pH時，主要考慮Cn和Ua之間的分離度（Rs以及分析的效率（分析周期短）zui終選擇緩沖能力zui強，分離度較佳（Rs＝4.1pH6.86為優化的分離pH

隨著流動相中甲醇比例的增加，3.2流動相中甲醇比例的選擇從圖1B中可以看出。各標志物的出峰時間隨之減少，分離周期大大縮短，但與此同時各標志物間的分離度也相應減少，當流動相中甲醇的比例大于40％時，各物質幾乎同時被洗脫出來，難以達到分離.zui終選擇流動相中甲醇含量為30％為較佳的比例（此時分析周期較短，各物質間分離度均大于2.0

隨著緩沖液濃度的增加，3.3流動相中緩沖液濃度對分離的影響從圖2A中可以看出。各標志物的峰面積隨之減小.而緩沖液濃度為5和10mmol/L時峰面積比較接近，zui終選擇緩沖能力較強的10mmol/L為*緩沖液濃度。

各物質間的分離度是逐漸增加的并且分析周期變短；而當流速從0.9mL/min增加到1.0mL/min后，3.4當流速從0.4mL/min增加到0.9mL/min時。雖然分析效率有所提高（分離周期從4.8min減少到4.0min但各物質間的分離度卻有所減小（此時的柱壓也過高：93.1bar.zui終選擇0.9mL/min為*流速。

CnCr和Ua糖尿病患者尿樣中的含量高于正常人（患者尿樣中Cr含量遠遠高于正常人尿液中Cr含量）而患者尿樣中U含量反而有所降低.這些都說明患者腎功能已經出現異常，3.5測定結果的分析從某糖尿病患者以及正常人尿樣測定的結果可以看出。非蛋白氮代謝產物不能很好的排出體外（對Cr排泄率增加，而U排泄率降低）這也從一個側面證實了患者的腎臟已經有了一定水平的損壞。