在ELISA試劑盒中一般有兩次抗原抗體反應，即加標本和加酶結合物后。抗原抗體反應的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育（incubation），有人稱之為孵育，在ELISA試劑盒中似不恰當。
ELISA試劑盒屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會，只有zui貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。
如果對試劑準備不太注意，在實驗時將試劑從冰箱中拿出來即用，而忽略了這種做法有可能影響后面溫育時間不夠的問題影響后面的操作。測定中試劑的準備zui為關鍵的是，在實驗開始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置20min以上后，以使試劑盒 
2. 當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡。
3. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
4. 一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
5. 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。
6. 如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定。
7. 在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，ELISA試劑盒不能混淆。
8. 底物請避光保存。
9、控制好每一步的操作時間。