一、單克隆抗體的概念和原理

　　免疫反應是人類對疾病具有抵抗力的重要因素。當動物體受抗原刺激后可產生抗體。抗體的特異性取決于抗原分子的決定簇，各種抗原分子具有很多抗原決定簇，因此，免疫動物所產生的抗體實為多種抗體的混合物。用這種傳統方法制備抗體效率低、產量有限，且動物抗體注入人體可產生嚴重的過敏反應。此外，要把這些不同的抗體分開也極困難。近年，單克隆抗體技術的出現，是免疫學領域的重大突破。 

　　（1）單克隆抗體的基本概念 抗體主要由b淋巴細胞合成。每個B淋巴細胞有合成一種抗體的遺傳基因。動物脾臟有上百萬種不同的B淋巴細胞系，含遺傳基因不同的B淋巴細胞合成不同的抗體。當機體受抗原刺激時，抗原分子上的許多決定簇分別激活各個具有不同基因的B細胞。被激活的B細胞分裂增殖形成該細胞的子孫，即克隆由許多個被激活B細胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多種抗體。如果能選出一個制造一種專一抗體的細胞進行培養，就可得到由單細胞經分裂增殖而形成細胞群，即單克隆。單克隆細胞將合成一種決定簇的抗體，稱為單克隆抗體。

　　（2）單克隆抗體技術的基本原理 要制備單克隆抗體需先獲得能合成專一性抗體的單克隆B淋巴細胞，但這種B淋巴細胞不能在體外生長。而實驗發現骨髓瘤細胞可在體外生長繁殖，應用細胞雜交技術使骨髓瘤細胞與免疫的淋巴細胞二者合二為一，得到雜種的骨髓瘤細胞。這種雜種細胞繼承兩種親代細胞的特性，它既具有B淋巴細胞合成專一抗體的特性，也有骨髓瘤細胞能在體外培養增殖永存的特性，用這種來源于單個融合細胞培養增殖的細胞群，可制備抗一種抗原決定簇的特異單克隆抗體。其制備原理示意如下：


單克隆抗體制備示意圖

二、基本方法

　　抗原提純與動物免疫 
　　對抗原的要求是純度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。如為細胞抗原，可取1×107個細胞作腹腔免疫。可溶性抗原需加*福氏佐劑并經充分乳化，如為聚丙烯酰胺電泳純化的抗原，可將抗原所在的電泳條帶切下，研磨后直接用以動物免疫。
　　選擇與所用骨髓瘤細胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠齡在8～12周，雌雄不限。為避免小鼠反應而不佳或免疫過程中死亡，可同時免疫3～4只小鼠。
　　免疫過程和方法與多克隆抗血清制備基本相同，因動物、抗原形式、免疫途徑不同而異，以獲得價抗體為zui終目的。免疫間隔一般2～3周。一般被免疫動物的血清抗體效價越高，融合后細胞產生價特異抗體的可能性越大，而且單克隆抗體的質量（如抗體的濃度和親和力）也與免疫過程中小鼠血清抗體的效價和親和力密切相關。末次免疫后3～4天，分離脾細胞融合。
　　骨髓瘤細胞及飼養細胞的制備
　　選擇瘤細胞株的zui重要的一點是與待融合的B細胞同源。如待融合的是脾細胞，各種骨髓瘤細胞株均可應用，但應用zui多的是Sp2/0細胞株。該細胞株生長及融合效率均佳，此外，該細胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈。細胞的zui高生長刻度為9×105/ml，倍增時間通常為10～15h。融合細胞應選擇處于對數生長期、細胞形態和活性佳的細胞（活性應大于95％）。骨髓瘤細胞株在融合前應先用含8-氮*的培養基作適應培養，在細胞融合的前一天用新鮮培養基調細胞濃度為2105/ml，次日一般即為對數生長期細胞。
　　在體外培養條件下，細胞的生長依賴適當的細胞密度，因而，在培養融合細胞或細胞克隆化培養時，還需加入其他飼養細胞（feedercell）。常用的飼養細胞為小鼠的腹腔細胞，制備方法為用冷凍果糖液注入小鼠腹腔，輕揉腹部數次，吸出后的液體中即含小鼠腹腔細胞，其中在巨噬細胞和其他細胞。亦有用小鼠的脾細胞、大鼠或豚鼠的腹腔細胞作為飼養細胞的。
　　在制備飼養細胞時，切忌針頭刺破動物的消化器官，否則所獲細胞會有嚴重污染。飼養細胞調至1×105/ml，提前一天或當天置板孔中培養。
　　細胞融合
　　細胞融合是雜交瘤技術的中心環節，基本步驟是將兩種細胞混合后加入PEG使細胞彼此融合。其后吧培養液稀釋PEG，消除PEG的作用。將融合后的細胞適當稀釋，分置培養板孔中培養。融合過程中有幾個問題應特別注意。①細胞比例：骨髓瘤細胞與脾細胞的比值可從1:2到1:10不等，常用1:4的比例。應保證兩種細胞在融合前都具有較高活性。②反應時間：在兩種細胞的混合細胞懸液中，第1min滴加4.5ml培養液；間隔2min滴加5ml培養液，爾后加培養液50ml。③培養液的成分：對融合細胞，良好的培養液尤其重要，其中的小牛血清、各種離子和營養成分均需嚴格配制。如融合效率降低，應隨時核查培養基情況。
　　有限稀釋法
　　篩選陽性株一般選用的骨髓瘤細胞為HAT敏感細胞株，所以只有融合的細胞才能待續存活一周以上。融合細胞呈克隆生長，經有限稀釋后（一般稀釋至0.8個細胞/孔），按Poisson法計算，應有36％的孔為1個細胞/孔。細胞培養至覆蓋0％～20％孔底時，吸取培養上清用ELISA檢測抗體含量。首先依抗體的分泌情況篩選出高抗體分泌孔，將孔中細胞再行克隆化，爾后進行抗原特異的ELISA測定，選高分泌特異性細胞株擴大培養或凍存。
　　單克隆抗體的制備和凍存
　　篩選出的陽性細胞株應及早進行抗體制備，因為融合細胞隨培養時間延長，發生污染、染包體丟失和細胞死亡的機率增加。抗體制備有兩種方法。一是增量培養法，即將雜交瘤細胞在體外培養，在培養液中分離單克隆抗體。該法需用特殊的儀器設備，一般應用無血清培養基，以利于單克隆抗體的濃縮和純化。zui普遍采用的是小鼠腹腔接種法。選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中去。通常在接種一周后即有明顯的腹水產生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有時甚至超過40ml。該法制備的腹水抗體含量高，每毫升可達數毫克甚至數十毫克水平。此外，腹水中的雜蛋白也較少，便于抗體的純化。接種細胞的數量應適當，一般為5×105/鼠，可根據腹水生長情況適當增減。

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