一、技術簡介

隨著社會生活水平的提高，人類健康問題也越來越多的受到社會各界的關注。傳統(tǒng)的遺傳疾病研究模式是采用顯帶分析、核型分析、FISH、遺傳標記、PCR-DNA測序等傳統(tǒng)試驗方法來尋找與疾病相關的DNA變異，這些方法各有各的特點，但都存在工作量大、效率低、分辨率低等一系列的限制。新一代高通量測序技術的出現(xiàn)，為遺傳疾病的研究提供了全新的思路。

2009年，基因組定向捕獲工具的出現(xiàn)使外顯子組測序成為可能。2009年9月，*篇關于外顯子組測序的原理驗證文章于Nature雜志上發(fā)表。來自華盛頓大學的Jay Shendure通過對四名Freeman-Sheldon綜合征患者的外顯子組測序，找到了已知的致病基因MYH3。隨后，該團隊將這種技術應用于米勒綜合征的研究，通過對患者編碼區(qū)序列的捕獲及深度測序，鑒定出單個候選基因DHODH，并經Sanger測序驗證其他患者中存在該基因的突變。

外顯子組的序列僅占全基因組序列的1%左右，但大多數(shù)與疾病相關的變異位于外顯子區(qū)。通過外顯子組測序可鑒定約8萬個變異，全基因組測序可鑒定300萬個變異，因此，與全基因組測序相比，外顯子組測序不僅費用較低，數(shù)據(jù)闡釋也更為簡單。外顯子組測序技術以其經濟、有效的優(yōu)勢廣泛應用于孟德爾遺傳病、罕見綜合征及復雜疾病的研究，并于2010年被Science雜志評為突破之一。近兩年外顯子組研究相關的SCI文章已發(fā)表千余篇，已對數(shù)百種疾病展開了深入研究，研究結果推動了人類醫(yī)學的研究。

二、技術優(yōu)勢

• 直接對蛋白編碼序列進行序列測定，找出影響蛋白結構的變異。
• 高深度測序，可發(fā)現(xiàn)常見變異及頻率低于1%的罕見變異。
• 針對外顯子組區(qū)域測序，約占基因組的1%，有效降低費用、周期、工作量。

三、應用舉例

四、方案設計

相比傳統(tǒng)測序，外顯子測序能夠迅速的獲得所有外顯子區(qū)域的遺傳信息，在大幅提升效率的同時顯著降低了研究成本；相比全基因組測序，外顯子測序能夠在縮短實驗周期、減少數(shù)據(jù)分析量及實驗投入的基礎上有針對性的得到大部分全基因組測序所能得到的信息。基于外顯子組測序良好性價比，該方法目前在上已經被廣泛的應用于遺傳病和癌癥研究中。

1. 單基因疾病研究方案

首先需要按照疾病表型對家系成員進行嚴格篩查，明確其患病情況并進行該疾病研究的背景調查。在找出該疾病已經有一些研究背景和相關的致病基因報道，可通過傳統(tǒng)PCR測序方法對已知的疾病相關變異進行驗證和初篩；確認所研究的樣本中未發(fā)現(xiàn)相關的基因變異，那么可以挑選一個或數(shù)個相同疾病家系的核心成員成員進行外顯子組測序。每個家系中的患病個體選取3-5個樣本，正常個體選取1-2名作為對照進行研究。按照疾病模型(AD，AR等)及樣品的家系信息對測序得到的結果進行分析，縮小候選變異的范圍，經過多種注釋、篩選后過濾掉對功能無影響的變異及公共數(shù)據(jù)庫中的常見變異，再使用傳統(tǒng)PCR測序進行樣本擴大化驗證及相關的功能研究，zui終確定疾病相關變異。

單基因遺傳病研究舉例：

a． 家系圖：

 
b． 分析思路：
1). 隱性純合突變致病：兩個患者共享相同的純合突變，父母為雜合攜帶者。
2). 復合雜合突變致病：兩個患者具有相同的突變，即在一個基因內有兩個不同的雜合變異，而父母分別為這兩個雜合突變的攜帶者。
3). 顯性模式（新生突變）：找兩個患者共有的雜合突變，而父母不帶有該突變。

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