微生物菌種保藏方法

菌種保藏方法
低溫斜面保藏法
把待保藏的菌種接在適合其生長(zhǎng)的培養(yǎng)基上，在合適的條件下培養(yǎng)，待培養(yǎng)基上的單菌落或孢子生長(zhǎng)充分后，于２～８℃ 的條件下進(jìn)行保存，并每隔１～ ２個(gè)月傳代接種一次，但是需要注意的是菌種的保藏時(shí)間及溫度因微生物的種類(lèi)不同而不同， 如霉菌、放線菌等保藏２～４ 個(gè)月需傳代１次，細(xì)菌每月傳代１次。
此法是國(guó)內(nèi)外常用的保存方法之一，適用菌系范圍比較 廣，簡(jiǎn)單易行，便于操作和觀察，成本比較低，很是適合工業(yè)生產(chǎn)的菌種保存；但是不適宜*保存，長(zhǎng)時(shí)間保存的話培養(yǎng)基很易失水，而使孢子失去活性，而且斜面、平板低溫保藏必須經(jīng)常傳代，轉(zhuǎn)代接種過(guò)程中易發(fā)生變異、污染雜菌、發(fā)生差錯(cuò)。因此，斜面、平板低溫保藏法適合短期保存常用菌種，應(yīng)該與*的菌種保藏方法相結(jié)合，以防菌系丟失。
半固體穿刺保藏法
配制半固體培養(yǎng)基，高壓濕熱滅菌后倒于無(wú)菌 試管中至約1/3，待培養(yǎng)基凝固，用接種環(huán)從平面培養(yǎng)基上挑取單菌落，穿入培養(yǎng)基若干次。在合適的條件下進(jìn)行培養(yǎng)至菌體旺盛生長(zhǎng)，之后密封試管， 根據(jù)菌種特點(diǎn)在4℃左右或者涼爽干燥處保存。保存時(shí)間至少可以達(dá)到1年，對(duì)于有些菌種甚至能達(dá)到20年之久。
方法優(yōu)缺點(diǎn):此方法主要適用于工程大腸桿菌等細(xì)菌，操作簡(jiǎn)便，保存時(shí)間較長(zhǎng)，適用于實(shí)驗(yàn)室使用，保存時(shí)注意培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)不宜過(guò)于豐富，以進(jìn)一步降低細(xì)菌的代謝。此法也可以用石蠟對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行液封從而延長(zhǎng)保藏時(shí)間。
甘油保藏法
先將甘油裝于三角瓶中，塞上棉塞并用牛皮紙包裹滅菌，然后放入無(wú)菌間內(nèi)備用，使用前先將甘油做無(wú)菌檢查。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將滅 菌后的甘油直接倒入長(zhǎng)好孢子的斜面或者平板內(nèi)，用量以高出斜面頂端0.5cm為宜，使菌種與空氣隔絕，然后在棉塞外包上牛皮紙，將試管直立置于－80℃的冰箱中保藏
方法優(yōu)缺點(diǎn):此保藏方法較斜面、平板低溫保藏法保藏時(shí)間長(zhǎng)，而且制作簡(jiǎn)單，不需經(jīng)常移種，但保藏時(shí)必須直立放置，所占空間較大，也不便于攜帶。且接種時(shí)因?yàn)楦视吞珴獬聿灰斯蜗骆咦印?br />甘油乳糖保藏法
配置甘油乳糖溶液，其實(shí)含甘油10％ ，含乳糖20％ ；裝于三角瓶中滅菌，然后放入無(wú)菌間內(nèi)備用，使用前先將甘油乳糖溶液做無(wú)菌檢查。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用無(wú)菌移液管吸 取適量的甘油乳糖溶液加入到長(zhǎng)好孢子的斜面內(nèi)，用無(wú)菌接種鏟刮下孢子分裝于５ml規(guī)格的甘油管內(nèi)，每支管油管裝量３ml，蓋嚴(yán)蓋子，做好標(biāo)記直立放于甘油管盒內(nèi)，然后放置于- 80℃的冰箱中保藏。
方法優(yōu)缺點(diǎn):此種保藏方法可以保存２年左右，保存時(shí)間較長(zhǎng)，實(shí)用的 菌系范圍也比較廣泛，成本比較低，而且在操作過(guò)程中簡(jiǎn)單易行，在以后的工作中不光是可以用于傳代，而且可以直接用于 搖瓶的接種，比較方便，是工業(yè)生產(chǎn)中常用的保存方法之一。
沙土管保藏法
取河沙過(guò)40～60目篩去粗粒后，用磁鐵反復(fù)吸取鐵屑，然后用10％ 鹽酸浸泡2 ～ 4ｈ 以除去有機(jī)質(zhì)，倒去酸水后用純化水反復(fù)沖洗至中性，烘干備用。另取非耕作層的不含腐殖質(zhì)的瘦黃土，用純化水浸泡使其呈中性，然后烘 干、碾碎過(guò)100目篩。將處理好的沙與土以１:１ 混勻， 分裝于小試管內(nèi)，每管裝1.5ｇ 左右，塞上棉塞，用牛皮紙包好滅菌，滅菌后進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，合格后使用。將培養(yǎng)成熟的優(yōu)良菌種（一般指孢子層 生長(zhǎng)豐滿(mǎn)的菌種）用無(wú)菌接種鏟刮下孢子放入到沙土管中，塞好棉塞放入盛有干燥劑的真空干燥器內(nèi)，用真空泵抽干水分。 抽真空時(shí)間一般為2～ 4小時(shí)為宜，以免孢子萌發(fā)。抽干的沙土管用無(wú)菌勺子搗松并每個(gè)種抽取１支回接于斜面培養(yǎng)基上， 進(jìn)行培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況和有無(wú)雜菌生長(zhǎng)。若經(jīng)檢查沒(méi)有問(wèn) 題，則將制備好的沙土管用牛皮紙包裹好棉塞放于干燥器中保存。
這種方法適用于能產(chǎn)生孢子的微生物，如霉菌、 放線菌，因此在抗生素工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣。保藏效果亦較好，可以達(dá)到2年左右。但是此法對(duì)于營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞效果不好。操作的時(shí)候應(yīng)該注意抽干一步務(wù)必要快，盡量在12 h內(nèi)完成，防止孢子萌發(fā)，降低保藏效果。
液體石蠟保藏法
將無(wú)菌干燥的液體石蠟注入上述培養(yǎng)好的斜面至高于斜面頂端1cm處，再將試管密封，直立于4℃左右冷藏保存，具體保存溫度隨菌種而變。注意要定期添 加石蠟保證斜面處于液面以下。保藏時(shí)間至少可以達(dá)到1年。
方法優(yōu)缺點(diǎn) 液體石蠟保藏法基本上克服了斜面低溫保藏法 保存時(shí)間短的缺點(diǎn)，然而液體石蠟保藏法由于要試管直立保存，因此比較耗費(fèi)空間，不便于攜帶。此法要注意以下兩點(diǎn)：①石蠟要保證無(wú)水，干熱160℃， 2 h滅菌后的石蠟可直接使用，若是用高壓濕熱 121℃，20min滅菌法滅菌，則要置于烘箱中至水分蒸發(fā)，石蠟液體變澄清后再使用；②用接種環(huán)取種復(fù)蘇時(shí)，注意接種環(huán)要充分冷卻防止液體石蠟飛 濺傷人圓。
冷凍真空干燥
將處于成熟期的微生物培養(yǎng)物(若微生物可以產(chǎn)生孢子，則應(yīng)該盡量使微生物大量產(chǎn)生孢子)懸浮于無(wú)菌的血清、卵白、脫脂奶或者海藻糖等保護(hù)劑中制成濃菌液，分裝到無(wú)菌的安瓿瓶中，于低溫冰箱中冷凍，達(dá)到預(yù)定溫度后對(duì)濃菌液進(jìn)行冷凍干燥處理， 之后在真空狀態(tài)下融封安瓿瓶，然后在冷藏或室溫下保存。
冷凍真空干燥法雖然操作復(fù)雜，需要使用冷凍 干燥以及抽真空的設(shè)備，然而一旦保存好，則可以小程度地減少微生物的改變、死亡和泄露擴(kuò)散， 因此適用于大批量菌種的*保存，特別是一些致病微生物的保存。該法是各種保存方法中為有效的方法之一，對(duì)于大多數(shù)微生物都適用。
液態(tài)氮超低溫保藏法
液態(tài)氮超低溫保藏法 液氮超過(guò)低溫保藏法是把菌種裝在含有冷凍保護(hù)劑的安瓿瓶?jī)?nèi)，將該安瓿瓶放入液氮（-196℃）中進(jìn)行保藏，由于菌絲體處于-196℃，其代謝降低到*停止的狀態(tài)。所以不需定期移植。液氮超低溫保藏法是菌種*保藏的有效可靠的方法。
保護(hù)劑：每管加進(jìn)0.8 毫升高壓滅菌的10%甘油 水溶液或10%二甲亞砜水溶液可作為冷凍保護(hù)劑。用無(wú)菌鑷子將這種帶有菌絲體的瓊脂塊移入加有保護(hù)劑的安瓿管中。用火焰將安瓿管上部熔封，浸在水中檢查有無(wú)漏氣。