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技術文章

ELISA實驗操作問題的解決方式

閱讀:371發布時間:2017-7-6

1、白介素elisa試劑盒試驗出現非常弱的結果,常見有7種原因,其解決方法如下:

1)可能原因:溫育的時間或者溫度不夠;
解決方法:校正溫育箱溫度。
 
2)可能原因:顯色反應時間太短;
解決方法:校正定時鐘準確定時。
 
3)可能原因:所用配制緩沖液的蒸餾水有問題;
解決方法:使用新鮮合格的蒸餾水。
 
4)可能原因:加入抗體/酶的稀釋液濃度太低;
解決方法:按照說明書保存試劑盒和準確配制工作液。校正移液器,吸嘴要配套,裝吸嘴時要緊密。
 
5)可能原因:酶標儀濾光片不正確;
解決方法:檢查酶標儀使用的濾光片。
 
6)可能原因:試劑盒沒有充分平衡;
解決方法:試劑室溫平衡至少20分鐘,確保所有試劑已平衡至室溫。
 
7)可能原因:不正確的試劑儲存方式;
解決方法:按照說明書要求保存試劑盒。
 
2、試驗的標準曲線和測定的重復性差,這是什么原因造成的?
答:試驗的標準曲線和測定的重復性差,這是典型的由測定操作引起的問題,常見原因如下:
 
a)可能原因:加樣本及試劑量不準;孔間不一致;
解決方法:校正移液器,吸嘴要配套,裝吸嘴時要緊密。
重復某一樣品時,加樣時間盡可能與次接近;
重復測定標本,操作條件、人員等應盡可能與上次保持一致,以排除這些因素造成的不一致的可能性;
樣品稀釋前應充分混勻。
 
b)可能原因:加樣過快,孔間發生污染;
解決方法:重復測定標本,操作條件、人員等應盡可能與上次保持一致,以排除這些因素造成的不一致的可能性;加樣不要過快。         
 
c)可能原因:加錯樣本;
解決方法:檢查記錄和試劑,是否加錯樣本。
 
d)可能原因:加樣本及試劑時,加在孔壁上部非包被區;
解決方法:加樣槍頭不要貼壁。
 
e)可能原因:不同批號試劑盒中組分混用;
解決方法:不同批號試劑盒中組分不可混用。
 
f)可能原因:溫育時間、洗板、顯色時間不一致;
解決方法:檢查時間是否一致。
 
g)可能原因:孔內污染雜物;
解決方法:離心樣品,排除雜物。
 
h)可能原因:試劑/樣品沒有混勻;
解決方法:充分混勻樣品和試劑。
 
i)可能原因:血清標本未*凝固即加入,反應孔內出現纖維蛋白凝固或殘留血    
細胞,易出現假陽性反應等。
解決方法:白介素elisa試劑盒待血清標本*凝固后做試驗。
 
3、 試驗結果白板,而且陽性對照不顯色,應如何分析和查找原因?
答:試驗結果白板,而且陽性對照不顯色,常見原因如下:
 
a)可能原因:漏加或者誤加試劑;
解決方法:檢查試驗記錄和剩余試劑。每次加液前均應核對標簽。
 
b)可能原因:試劑過期;
解決方法:使用有效期內的產品。
 
c)可能原因:洗板液配制中出現問題,如量筒不干凈含HRP酶抑制物(疊氮鈉 
等);
解決方法:使用干凈的器皿,正確配制試劑。
 
d)可能原因:溫育的時間或溫度不夠;
解決方法:校正溫育箱溫度。
 
e)可能原因:標準品失活或者丟失;
解決方法:標準品正確保存、溶解和混勻。
 
f)可能原因:抗體失活或者丟失;
解決方法:更換抗體或者提高抗體濃度
 
g)可能原因:酶失活或者丟失
檢查方法:把工作濃度的酶再稀釋20-100倍,取5uL加入50ul的顯色底物,終止后顯色是否能達到1.0左右,此為酶的粗略估計。
解決方法:更換酶或者提高酶的濃度。  
 
h)可能原因:顯色底物失活
檢查方法:加少量的工作濃度的酶,TMB是否很快顯色。
解決辦法:更換顯色底物.
 
4. 試驗結果空白背景高,這是什么原因造成的?
答:試驗結果空白背景高,常見原因如下:
 
a)可能原因:洗板不干凈;
解決方法:充分洗滌,*拍干;洗板要防止交叉污染;濃縮洗液準確配制;吸嘴盡可能一次性使用;加樣或加酶拍板的濾紙應棄去不用,不要反復使用,否則易造成污染。
 
b)可能原因:顯色液變質或者試劑過期;
解決方法:檢查試劑盒有效期。
 
c)可能原因:試劑稀釋有誤,如加酶的濃度過高;
解決方法:請按說明書所示稀釋倍數配制;
 
d)可能原因:蒸餾水受酶等污染;
解決方法:使用新鮮蒸餾水;
 
e)可能原因:試劑混用;
解決方法:不同批號試劑勿混用。
 
f)可能原因:培養箱溫度超過37℃或反應時間過長。
解決方法:白介素elisa試劑盒顯色反應時間適當縮短。


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