原代細胞絕大多數(shù)培養(yǎng)基是建立在平衡鹽溶液(BSS)基礎(chǔ)上,添加了氨基酸、維生素和其它與血清中濃度相似的營養(yǎng)物質(zhì)。Z廣泛應用的培養(yǎng)基是Eearle`s MEM 的混合物,其中含有13種必須氨基酸、8種維生素。而Ham`s F12 也包括非必須氨基酸,維生素的范圍亦很廣,另外常規(guī)含有無機鹽和代謝添加劑(例如核苷酸)。MEM/F12 這兩種培養(yǎng)基各取1/2,形成神經(jīng)生物學Z通用的培養(yǎng)基。Dulbecco`s改良培養(yǎng)基——DMEM,現(xiàn)應用于快速生長的細胞,同MEM含有相同的營養(yǎng)成分,但濃度高出2~4倍。選擇某種培養(yǎng)基,應仔細了解成分表,應知道大多數(shù)情形下培養(yǎng)基都有不足。例如,有些培養(yǎng)基在氨基酸中包括有谷氨酸,而這種培養(yǎng)基雖廣泛用于神經(jīng)生物學領(lǐng)域,但它對某些對谷氨酸敏感的可能有細胞外毒性損傷的神經(jīng)元而言,則并非選擇,特別是如果神經(jīng)元生長在缺乏膠質(zhì)的環(huán)境中時。F12中含有硫酸亞鐵,據(jù)報道也有神經(jīng)毒效應。
在所有這些培養(yǎng)基中,谷氨酸比其他氨基酸有更高的濃度,這是因為它具有不穩(wěn)定性以及在許多細胞培養(yǎng)中它常用作碳源。對于神經(jīng)元的培養(yǎng)常常在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸(若培養(yǎng)基中這兩種物質(zhì)缺乏時)。MEM與F12均要用5%的CO2來平衡,DMEM含更高濃度的NaCO3,要用10%的CO2來平衡,當然也可以在較低CO2濃度下使用。這些基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成成分是建立在對不同細胞系生長的研究之上的,但通常在原代培養(yǎng)中使用也能有比較令人滿意的結(jié)果。
原則上,HEPES作為緩沖劑可用來代替碳酸氫鹽,以解除需要高濃度CO2培養(yǎng)環(huán)境的限制。實際操作中并非如此簡單。顯然,溶解的CO2與碳酸氫鹽對良好的細胞生長是重要的。Leiboviz`s L15培養(yǎng)基可用來在大氣環(huán)境中令神經(jīng)細胞生長,該培養(yǎng)基采用了與眾不同的BSS作基礎(chǔ),它含有高濃度的氨基酸來提高緩沖能力,培養(yǎng)基中使用半乳糖作碳源,以阻止培養(yǎng)基中乳酸形成,少量溶解的CO2由丙酮酸代謝產(chǎn)生。這一培養(yǎng)基的優(yōu)點是明顯的,特別是在保持較高CO2有困難時,例如在長時間的顯微操作及生理學研究中。L15培養(yǎng)基已用來成功的培養(yǎng)了外周神經(jīng)元,但尚未在CNS神經(jīng)元的發(fā)育研究中全面檢測過。
無血清培養(yǎng)基
1979年神經(jīng)細胞培養(yǎng)出現(xiàn)了一個重要進展,用化學添加劑即可維持神經(jīng)細胞存活與生長而不需要在培養(yǎng)基中添加血清。其工作基礎(chǔ)是用合適的激素、營養(yǎng)物和促貼壁的物質(zhì)的組合置換培養(yǎng)基中的成分,Z后找到了適合大多數(shù)細胞培養(yǎng)的試劑配方,該配方稱為N2,專門用于原代細胞培養(yǎng),Z早是用在B104大鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞系的培養(yǎng)。它的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是1:1的DMEM與H12的混合液,添加了胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、腐胺和硒。胰島素和胰島素樣生長因子對于大多數(shù)類型細胞的存活和生長有重要作用,硒是谷胱甘肽產(chǎn)生的合作因子,可能有助于過氧化物和超氧化物的水解,有報道說還能防止細胞的光照損傷。隨后的其他配方如N1N3則含有較低濃度的轉(zhuǎn)鐵蛋白。
未料到的是上述配方構(gòu)成的培養(yǎng)基可以支持神經(jīng)母細胞瘤細胞系快速增殖,隨后又發(fā)展了能支持原代培養(yǎng)的各種神經(jīng)元生長的培養(yǎng)基,這種培養(yǎng)基在許多實驗室里已取代了有血清培養(yǎng)。在某些培養(yǎng)方案中,細胞直接進入無血清培養(yǎng),這樣的培養(yǎng)基可以消除來自血清的不均一性。更為重要的是,它們可用來檢測生長因子以及其他促進神經(jīng)元存活或生長的因子,或者用來檢測那些可保護神經(jīng)元免遭環(huán)境毒物損傷的制劑。于神經(jīng)元的培養(yǎng)基在某些培養(yǎng)環(huán)境中還可以減低非神經(jīng)元細胞的增殖,故可使神經(jīng)元純化。
血清中含有的組分,例如血清蛋白,可作為代謝毒物清除劑使用并能聚集于培養(yǎng)基中。當缺乏這些成分時,如神經(jīng)元在無血清培養(yǎng)基中生長時,特別容易為過氧化物及自由基傷害,這已被許多研究者注意到了。過氧化物酶以及超氧化物歧化酶可阻止培養(yǎng)基中過氧化物和超氧化物的累積,有報道講可以促進低密度培養(yǎng)細胞的存活。有學者發(fā)現(xiàn)細胞存活可為氧分壓的下降而促進。因而,無血清培養(yǎng)基的配方常含有抗氧化劑的試劑。例如,維生素E和丙酮酸,可作為過氧化物清除劑使用。上述這些影響在高密度培養(yǎng)時變小,特別是神經(jīng)元與膠質(zhì)共培養(yǎng)時,它們可以吸收和代謝神經(jīng)元毒性物質(zhì)如谷氨酸。
應該注意,盡管無血清培養(yǎng)基是有化學限定性的,但在培養(yǎng)過程中它仍有變動,培養(yǎng)起始時可能有些物質(zhì)缺乏,而后細胞的產(chǎn)物可能積累,從而使培養(yǎng)基的成分改變。這其實是有另一方面的好處,即條件培養(yǎng)基(已培養(yǎng)過細胞的培養(yǎng)基)的形成,條件培養(yǎng)基常常用來增加神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的發(fā)育。
生長因子絕大多數(shù)哺乳類胚胎神經(jīng)元有嚴格的營養(yǎng)要求,若不能提供適宜的生長因子或合適的因子組分,將會使絕大多數(shù)神經(jīng)元在體外培養(yǎng)的數(shù)天中死亡。解決這一問題有兩條思路,一是讓培養(yǎng)細胞提供自己的營養(yǎng)因子,二是在培養(yǎng)基中加入純的生長因子。如果細胞混合物能在高密度時生長,所需的生長因子便會積累到可觀的數(shù)值,尤其當培養(yǎng)基很少變化時。若某種細胞混合物生長時有很少的營養(yǎng)需求,可保持培養(yǎng)基在一段時間里不作任何變動,以使營養(yǎng)(生長)因子積累,而Z后促使所需要的細胞類型能夠生長。但是,這種對營養(yǎng)(生長)因子自身倚賴性亦有弊端,因為通常在混合細胞群體中細胞很難有同比例增殖,某些細胞會因生長條件的貧乏而受限制。另外,這種方法只能進行相當高密度的原代細胞培養(yǎng)。因為培養(yǎng)基的條件在細胞的較低密度時變的不夠有效。不過某些時候純化神經(jīng)元群體的低密度培養(yǎng)可用條件培養(yǎng)基(經(jīng)過了高密度培養(yǎng))進行,或在膠質(zhì)上生長的神經(jīng)元所用過的培養(yǎng)基來支持。
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