豬細小病毒抗體（PPV-Ab）ELISA試劑盒檢測原理
試劑盒采用雙抗一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被豬細小病毒（PPV）抗原的包被微孔中，依次加入標本、HRP標記的檢測抗原，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧
化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成Z終的黃色。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD 值），與CUTOFF值相比較，從而判定標本中豬細小病毒抗體（PPV-Ab）的存在與否。
樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細胞迅速小心地
分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。
3. 細胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘
取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
自備物品
1. 酶標儀（450nm）
2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3. 37℃恒溫箱
操作注意事項
1. 試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20 分鐘。從冰箱取出的
濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正常現(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶*溶解
后再使用。
2. 實驗中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。3. 預(yù)處理后的樣本請按照操作步驟用樣本稀釋液適當稀釋以達到試劑盒的的Z佳檢測效果。
4. 嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。
5. 所有液體組分使用前充分搖勻。
試劑盒組成
名稱 96孔配置 48孔配置 備注
微孔酶標板12 孔×8 條12 孔×4 條無
陰性對照0.5mL 0.5mL 無
陽性對照0.5mL 0.5mL 無
檢測抗原-HRP 10mL 5mL 無
20×洗滌緩沖液25mL 15mL 按說明書進行稀釋
樣本稀釋液6mL 3mL 無
底物A 6mL 3mL 無
底物B 6mL 3mL 無
終止液6mL 3mL 無
封板膜2 張2 張無
說明書1 份1 份無
自封袋1 個1 個無
試劑的準備
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20 稀釋，即1 份的20×洗滌緩
沖液加19 份的蒸餾水。
洗板方法
1. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min 后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5 次。
2. 自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5 次。
豬細小病毒抗體（PPV-Ab）ELISA試劑盒操作步驟
1. 從室溫平衡20min 后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2. 設(shè)置陰、陽性對照孔和樣本孔，陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照各50μL；
3. 待測樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；
4. 隨后陰、陽性對照孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）
標記的檢測抗原100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫
箱溫育60min。
5. 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5 次（也可用洗板機洗板）。6. 每孔加入底物A、B 各50μL，37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入終止液50μL，15min 內(nèi)，在450nm 波長處測定各孔的
OD 值。
結(jié)果判斷
1. 試驗有效性：陽性對照孔OD 值平均值≥1.00；陰性對照孔OD 值平均值≤0.15。
2. 臨界值（Cut off）計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15
3. 陰性判斷：樣品OD 值＜臨界值（Cut off），樣品為陰性
4. 陽性判斷：樣品OD 值＞臨界值（Cut off），樣品為陽性
試劑盒性能
1. 準確性：陽性對照孔OD 值平均值≥1.00；陰性對照孔OD 值平均
值≤0.15，說明試驗結(jié)果有效。
2. 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。
3. 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。
4. 貯藏：2-8℃，避光防潮保存。
5. 豬細小病毒抗體（PPV-Ab）ELISA試劑盒有效期：6 個月