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人正常組織來源細胞消化的要點

時間:2018/6/5閱讀:237
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人正常組織來源細胞消化的一般程序步驟,細節(jié)操作,我這里就不講了,只講一些基本操作背后的知識,如有不妥之處,歡迎指正,一起討論:

1. 絕大部分細胞消化的時候是只要用胰酶潤洗一遍即可。吸去胰酶后,殘留的那些無法計算體積的附著在細胞表面的微量胰酶在37℃一般不到2min足夠消化細胞(絕大部分1min不到)。對于這些細胞原則上不要用胰酶孵育細胞,連續(xù)這樣傳代,對細胞傷害很大。簡單的程序是PBS潤洗吸去,胰酶潤洗吸去,然后37℃消化。

2.什么算是消化好了呢?不是細胞全部成間隔分布很離散的單個圓形才算消化好了,一般你肉眼觀察貼壁細胞層,只要能移動了,多半呈沙壯移動,其實已經(jīng)可以了,很多人喜歡把細胞消化或者吹打成*分離細胞,這是沒有必要的。一般能移動了,說明細胞與培養(yǎng)基質材料的附著已經(jīng)消失了,細胞之間的附著也已經(jīng)消失了,細胞已經(jīng)獨立分布了(雖然沒有呈現(xiàn)很廣的離散分布)。這個時候應該停止消化,不要等到看到鏡下所有細胞都分離得非常好,間隙很大,才停止。細胞就是*成單個細胞懸液,之后在貼壁的過程中仍然會聚集,這個是貼壁培養(yǎng)的細胞,尤其是腫瘤細胞的一個特性,無論死活的細胞都是如此,你可以嘗試,準備的單個細胞懸液,貼壁后觀察細胞,仍然是幾個幾個細胞聚集在一起。一些懸浮培養(yǎng)細胞也是如此,容易聚集,不要去嘗試過幾個小時就拿出來吹打成單細胞懸液(不要笑,這個是初養(yǎng)懸浮細胞的人常犯的錯誤,以為懸浮培養(yǎng)就是一個一個分開)。細胞只要能從基質上脫離下來,這個時候即使是成片的(比如Calu-3細胞),吹打不超過20次后(一般10次即可),成小規(guī)模聚集(10個細胞左右),是正常的,不要試圖再去延長消化時間,或者象有的同學那樣吹打1h,等待單細胞懸液出現(xiàn)。

3.另一個帖子里提到一個比較復雜的四步消化法,這個挺有意思,我也是*次聽說,應該是網(wǎng)友自己發(fā)展出來的方法,很有參考價值。但我估計這個方法可能對付少數(shù)非常怪異的細胞才需要這么復雜的程序。我目前養(yǎng)過的近300株細胞里面,還沒遇到這么怪異的。比如Caco2其實是很好消化的細胞,不需要胰酶孵育即可,只是有點成片分布。不要以為成片分布是自己沒養(yǎng)好,這個視細胞而定。如果和標準形態(tài)不一致,那可能是自己沒消化好導致的,但如果消化方法正確,仍然成片分布,甚至*吹打成單細胞懸液,貼壁后仍然成片分布,這是細胞的特性,是因為貼壁過程中重新聚集了。這個時候你拼了命要去讓它均勻分布,你的細胞之后會對你越來越不好。

4.比較難消化的細胞(潤洗方法5min還不能消化),就以coloncancer為例,比如HCT15,LS411和KM12,這樣的細胞一般需要用少量胰酶孵育,但也不需要很多,一般100mm dish,一次Z多加入500ul,就足夠了,一般我加300ul。即使這樣難消化的細胞,一般不超過5min,即可見細胞成片移動,就應該停止消化。一些正常細胞也會有難消化的時候,比如tsDC細胞,但也只要用少量胰酶孵育,3min左右即可看到成片沙狀移動。

5,常規(guī)的細胞實驗(增殖,凋亡,遷移,分化之類的),受消化影響不是很大,如果不用胰酶去孵育而使用潤洗的方法消化(難消化細胞例外)即可。但少數(shù)實驗,比如病毒包裝,對細胞代數(shù),對細胞狀態(tài)要求*。這個時候,胰酶消化,就是潤洗,都會對人正常組織來源細胞包裝病毒的能力有影響,傳代次數(shù)一多,細胞包裝能力就會逐漸下降(當然也有其它因素影響包裝效率)。這個時候都不用胰酶消化,用一些鹽溶液(不是EDTA液)即可。這些鹽溶液通過影響ECM相關酶的活性,來使得細胞脫離基質附著表面,但不切割任何蛋白。

1 x 10^6 cells/vial 人小腦顆粒細胞 HCGC

1 x 10^6 cells/vial 人海馬趾神經(jīng)細胞 HN-h

1 x 10^6 cells/vial 人少突膠質前體細胞-貼壁生長 HOPC

5 x 10^6 cells/vial 人少突膠質前體細胞-懸浮生長 HOPC-os

1 x 10^6 cells/vial 人少突膠質細胞 HO

1 x 10^6 cells/vial 人星形膠質細胞 HA

5 x 10^6 cells/vial 人星形膠質細胞 HA

10 x 10^6 cells/vial 人星形膠質細胞 HA

5 x 10^5 cells/vial 人小腦星形膠質細胞 HA-c

5 x 10^5 cells/vial 人脊髓星形膠質細胞 HA-sp

5 x 10^5 cells/vial 人海馬星形膠質細胞 HA-h
人正常組織來源細胞

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