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細(xì)胞株培養(yǎng)小室

時(shí)間:2017/12/12閱讀:348
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1.細(xì)胞株復(fù)蘇代數(shù)靠前的腫瘤細(xì)胞,在含有10% FBS的培養(yǎng)基 中預(yù)先培養(yǎng)2-3代,待細(xì)胞匯合達(dá)到80%左右,饑餓處 理18-24小時(shí)。
2.準(zhǔn)備鋪膠:
a) 4 °C溶EMC膠過(guò)夜。
b) 將細(xì)胞小室、培養(yǎng)板和槍頭等于4°C 預(yù)冷。
c)用無(wú)血清的冷培養(yǎng)基稀釋ECM膠至20ug/mL,以5-10ug/cm2的密度加入到細(xì)胞小室的上層(按照ECM產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的推薦比例和體積),輕輕搖晃使膠均勻鋪在膜上。以上操作在冰上進(jìn)行。
d)立即將鋪好ECM膠的細(xì)胞小室置于培養(yǎng)板中,于37℃孵育1小時(shí),ECM膠可由液體凝成固體,吸走多余的或者未凝的膠。
3.細(xì)胞用PBS清洗一次,EDTA或者0.05%胰酶消化,然后用包含5% BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基中和,1500rpm離心5-10min。
4.用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度至0.5-2.0 x106cell/ml。
5.取上述200μL細(xì)胞液加入小室,下室(培養(yǎng)板)加入900L含有10% FBS的培養(yǎng)基。不同規(guī)格的小室和培養(yǎng)板所加的體積不同,具體參考Millicell R 產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)以配合24孔板的8μM PET膜Millicell 懸掛式細(xì)胞培養(yǎng)小室(cat#MCEP24H48)為例,實(shí)驗(yàn)周期:3-5天
6. 37 ℃孵育24至72小時(shí),依據(jù)腫瘤細(xì)胞類型而定。
7.孵育結(jié)束,小心取出細(xì)胞小室,吸掉小室上層培 養(yǎng)液,PBS清洗一遍,70%酒精或者4%多聚甲醛固 定5min,0.5%結(jié)晶紫(2%乙醇或PBS溶解)染色 20min,然后進(jìn)行第8步或者第9步。
8. PBS清洗兩次以去除多余的染料,立即用棉簽擦 去濾膜上層的細(xì)胞,自然靜置風(fēng)干。顯微鏡下觀察 濾膜下層的細(xì)胞,隨機(jī)選取不同的視野計(jì)數(shù)并算平均值。
9. 結(jié)晶紫溶解濾膜下層細(xì)胞株,然后用33%醋酸脫色, 將結(jié)晶紫*洗脫下來(lái),洗脫液可在酶標(biāo)儀上570 nm讀取OD值。這種方法可以避免視野下細(xì)。
20mg/支    "分子式:  C30H52O4 
分子量:  476 
"    20(R)原人參三醇    20(R)Protopanaxatriol
        雪膽素甲    
        雪膽素乙    
20mg/支    479-91-4    蔓荊子黃素    Vitexicarpin
        龍血素B    
10mg/支    102036-29-3    原蘇木素B    Protosappanin B
        辛夷脂素    
20mg/支    13476-25-0    烏藥醚內(nèi)酯    Linderane
20mg/支    528-48-3    漆黃素    Fisetin
        苦玄參苷IA    
20mg/支    1415-73-2    蘆薈苷    Aloin
細(xì)胞株

 

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