1.細(xì)胞株復(fù)蘇代數(shù)靠前的腫瘤細(xì)胞，在含有10% FBS的培養(yǎng)基 中預(yù)先培養(yǎng)2-3代，待細(xì)胞匯合達(dá)到80%左右，饑餓處 理18-24小時(shí)。
2.準(zhǔn)備鋪膠：
a) 4 °C溶EMC膠過(guò)夜。
b) 將細(xì)胞小室、培養(yǎng)板和槍頭等于4°C 預(yù)冷。
c)用無(wú)血清的冷培養(yǎng)基稀釋ECM膠至20ug/mL，以5-10ug/cm2的密度加入到細(xì)胞小室的上層（按照ECM產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的推薦比例和體積），輕輕搖晃使膠均勻鋪在膜上。以上操作在冰上進(jìn)行。
d)立即將鋪好ECM膠的細(xì)胞小室置于培養(yǎng)板中，于37℃孵育1小時(shí)，ECM膠可由液體凝成固體，吸走多余的或者未凝的膠。
3.細(xì)胞用PBS清洗一次，EDTA或者0.05%胰酶消化，然后用包含5% BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基中和，1500rpm離心5-10min。
4.用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至0.5-2.0 x106cell/ml。
5.取上述200μL細(xì)胞液加入小室，下室（培養(yǎng)板）加入900L含有10% FBS的培養(yǎng)基。不同規(guī)格的小室和培養(yǎng)板所加的體積不同，具體參考Millicell R 產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)以配合24孔板的8μM PET膜Millicell 懸掛式細(xì)胞培養(yǎng)小室（cat#MCEP24H48）為例，實(shí)驗(yàn)周期：3-5天
6. 37 ℃孵育24至72小時(shí)，依據(jù)腫瘤細(xì)胞類型而定。
7.孵育結(jié)束，小心取出細(xì)胞小室，吸掉小室上層培 養(yǎng)液，PBS清洗一遍，70%酒精或者4%多聚甲醛固 定5min，0.5%結(jié)晶紫（2%乙醇或PBS溶解）染色 20min，然后進(jìn)行第8步或者第9步。
8. PBS清洗兩次以去除多余的染料，立即用棉簽擦 去濾膜上層的細(xì)胞，自然靜置風(fēng)干。顯微鏡下觀察 濾膜下層的細(xì)胞，隨機(jī)選取不同的視野計(jì)數(shù)并算平均值。
9. 結(jié)晶紫溶解濾膜下層細(xì)胞株，然后用33%醋酸脫色， 將結(jié)晶紫*洗脫下來(lái)，洗脫液可在酶標(biāo)儀上570 nm讀取OD值。這種方法可以避免視野下細(xì)。
20mg/支    "分子式：  C30H52O4 
分子量：  476 
"    20(R)原人參三醇    20(R)Protopanaxatriol
        雪膽素甲    
        雪膽素乙    
20mg/支    479-91-4    蔓荊子黃素    Vitexicarpin
        龍血素B    
10mg/支    102036-29-3    原蘇木素B    Protosappanin B
        辛夷脂素    
20mg/支    13476-25-0    烏藥醚內(nèi)酯    Linderane
20mg/支    528-48-3    漆黃素    Fisetin
        苦玄參苷IA    
20mg/支    1415-73-2    蘆薈苷    Aloin
細(xì)胞株