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原代細(xì)胞傳代培養(yǎng)的操作介紹

時(shí)間:2017/5/9閱讀:473
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1.觀察培養(yǎng)基是否正常,原代細(xì)胞狀態(tài)如何,細(xì)胞密度如何,決定是否傳代。觀察時(shí)擰緊蓋子。
2.加熱PBS、versene、培養(yǎng)基,(提前做好) 瓶子不要倒著放,不要讓液體接觸到瓶塞。
3.打開超凈臺(tái)(先開風(fēng)機(jī),后開照明),用75%乙醇清潔臺(tái)面,點(diǎn)燃酒精燈。不要把廢液缸拿出去倒,如果廢液太多,可以用其他容器先裝廢液。取小離心管一個(gè),置于架子上。
4.取尖吸管、吸量管各一支,放置在的架上。放置的方式,注意吸管、吸量管前端都不要與架子接觸。
5.取待傳代的細(xì)胞。打開versene,用酒精燈外焰燒。燒吸管時(shí)距離酒精燈心遠(yuǎn)些,不要把渣滓?guī)нM(jìn)去。把試劑拿入臺(tái)子的時(shí)候,盡量平穩(wěn),不要讓試劑碰到瓶口。
6.用吸量管吸取舊的培養(yǎng)基,置離心管中,吸量管加入versene,然后將versene瓶收起來。(加versene主要是為了將舊培養(yǎng)基洗去)。在離心管中間部分將液體加入。吸液體和加液體時(shí)都不要對(duì)著細(xì)胞。
7.打開胰酶,然后將versene棄掉。換新管,用尖吸管吸取適量胰酶加入。加胰酶后,盡快放平,使原代細(xì)胞消化時(shí)間一致。
8.將細(xì)胞放入37度孵箱。放孵箱2min, 收胰酶,打開PBS. 之后拿出來鏡下隨時(shí)觀察。使用二次消化法,去除容器中殘余的細(xì)胞。別忘了用舊培養(yǎng)基中和。
9.取細(xì)胞,鏡下觀察消化情況。消化程度合適之后(細(xì)胞變圓,但不漂起),用尖吸管棄去胰酶,取離心管中的培養(yǎng)基加入細(xì)胞,吹打,至所有細(xì)胞從培養(yǎng)皿底部脫落下來。用PBS洗細(xì)胞,versene對(duì)細(xì)胞有毒性,且不能被血清中和。然后吸取至離心管中,800 rpm離心5分鐘。
10.吸量管吸取適量培養(yǎng)基加入新的培養(yǎng)皿中。
11.細(xì)胞離心畢,用吸新培養(yǎng)基的管棄去上清,先把泡沫吸走。換吸量管吸取培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基適量,加入離心管,小體積混勻,將細(xì)胞重懸,尖吸管吹勻。
12.擦計(jì)數(shù)板,用槍吸10ul的液體,計(jì)數(shù)。不要把槍伸到離心管內(nèi)。
13.吸量管吸取原代細(xì)胞懸液,加入新的培養(yǎng)皿中。鏡下觀察,搖勻,放入37度孵育。收超凈臺(tái)。

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