細胞簡介：

兔Ⅱ型肺泡上皮細胞分離自肺組織；肺泡由單層上皮細胞構成的半球狀囊泡。肺中的支氣管經多次反復分枝成無數細支氣管，它們的末端膨大成囊，囊的四周有很多突出的小囊泡，即為肺泡。小肺泡細胞，又稱I型肺泡細胞，厚約0.1微米，基底部是基底膜，無增殖能力。大肺泡細胞，又稱Ⅱ型肺泡細胞，分泌表面活性物質（二棕櫚酰卵磷），以降低肺泡表面張力。Ⅱ型肺泡細胞位于Ⅰ型肺泡細胞之間，數量較Ⅰ型肺泡細胞多，但覆蓋面積比Ⅰ型肺泡細胞小。細胞立方形或圓形,頂端突入肺泡腔。細胞核圓形，胞質著色淺、呈泡沫狀。電鏡下，細胞游離而有少量微絨毛，胞質內富含線粒體和溶酶體，有較發達的粗面內質網和高爾基復合體。核上方有較多的分泌顆粒，電子密度高、大小不等，直徑約0.1-1.0μm顆粒內含有平行排列的板層狀結構，稱為嗜餓性板層小體。小體內的主要成分為磷脂，以二棕櫚酰卵磷為主，此外還有糖胺多糖及蛋白質等。顆粒內物質釋放出來后，在肺泡表面形成一層粘液層，稱為表面活性物質（surfactant）。表面活性物質有降低肺泡表面張力、穩定肺泡大小的作用。呼氣時肺泡縮小，表面活性物質密度增加，表面張力降低，防止肺泡過度塌陷；吸氣時肺泡擴張，表面活性物質密度減小，肺泡回縮力加大，可防止肺泡過度膨脹。表面活性物質的缺乏或變性均可引起肺不張，過度通氣可造成表面活性物質缺乏；吸入毒氣可直接破壞表面活性物質。Ⅱ型肺泡細胞有分裂、增殖并分化為Ⅰ型肺泡細胞的潛能，故具有修復受損傷上皮的作用。
方法簡介：

實驗室分離的兔Ⅱ型肺泡上皮細胞采用膠原酶-中性蛋白聯合消化結合差速貼壁法，并通過上皮細胞專用培養基培養篩選制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。
質量檢測：

實驗室分離的兔Ⅱ型肺泡上皮細胞經SP-C免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

1) 將5-10d的乳鼠浸泡入75%乙醇中，移入生物安全柜，

2) 從胸部解剖乳鼠，取出雙肺置于預冷的PBS中，盡可能的除去結締組織等，

3) 取肺邊緣部分，剪碎，將組織塊移入T25培養瓶中，倒置于細胞培養箱中，

4) 2h后，培養瓶中注入2 mL內皮培養基，小心將培養瓶正置于培養箱，確保組織塊不會飄起來，

5) 每3d換液2mL，待細胞從組織塊中爬出來后，隔2d換液，待細胞融合達到60-70%左右時，去除組織塊，將肺微血管內皮細胞重新鋪瓶。

1、您收到細胞后，請按照以下方法進行操作：

取出T-25cm2培養瓶，75%酒精擦拭培養瓶，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2細胞培養箱中靜置4-6小時或過夜，以穩定細胞狀態，然后換用新鮮培養液繼續培養或進行傳代。

2、細胞傳代：

1）細胞生長至覆蓋培養瓶的80%面積時，棄25cm2培養瓶中的培養液，用PBS清洗細胞一次；

2）添加0.125%消化液約2ml至培養瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后加入培養液終止消化，再輕輕吹打細胞使之脫落，然后將懸液轉移至15ml離心管中，1500rpm/min，離心5min；

3）棄上清，沉淀細胞用12ml培養基重懸，然后按1:2比例進行分瓶傳代，放入37℃，5%CO2細胞培養箱中培養；

4）待細胞貼壁后，觀察培養結果，之后進行換液培養或傳代。

3、細胞凍存：

1）細胞生長至覆蓋培養瓶的80%面積時，棄25cm2培養瓶中的培養液，用PBS清洗細胞一次；

2）添加0.125%消化液約2ml至培養瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后輕輕吹打細胞使之脫落，再加入培養液終止消化，然后將懸液轉移至15ml離心管中，1500rpm/min，離心5min；

3）用適當量的凍存液（基礎培養基：FBS：DMSO=7:2:1）重懸細胞，并放置于凍存管中；

4）先將細胞凍存管放置于-20℃ 1.5h，然后將其移入-80℃過夜，24h后轉入液氮中進行長期保存。

4、細胞復蘇：

1）從液氮中取出細胞凍存管（注意：佩戴防爆管面具）， 快速將其置入37℃水浴中解凍，直至凍存管中無結晶，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；

2）將凍存管中的細胞移至15ml無菌離心管中，滴加入培養液5ml混勻細胞，然后將細胞懸液轉移至適當面積大小的培養皿中；

3）放置于37℃，5%CO2細胞培養箱中培養；

4）第二天，換用新鮮培養基繼續培養。