PCR檢測注意事項

時間：2022/10/17閱讀：473

PCR反應(yīng)擴(kuò)增出了高的拷貝數(shù)，下一步檢測就成了關(guān)鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是極常用的檢測手段。電泳法檢測特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因為其簡捷易行，成為了主流檢測方法。近年來以熒光探針為代表的檢測方法，有逐漸取代電泳法的趨勢。PCR檢測注意事項：

1. 由于PCR反應(yīng)靈敏度很高，因此要特別主意防止DNA污染的發(fā)生。樣品間的相互污染可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果，特別是將PCR技術(shù)應(yīng)用到臨床病原菌感染確定中。

2. 如果是公用的、沒有密碼保護(hù)的PCR儀，經(jīng)常檢查PCR儀上的程序正確與否。

3. 不使用過量試劑“l(fā)ess is usually better (more specific)"。

4. 試劑購回后應(yīng)分裝成小份使用，這樣一旦有污染發(fā)生，可以立即丟棄污染的試劑，不會造成大的損失；試劑分裝也有助于減少反復(fù)凍融次數(shù)（例如dNTPs對反復(fù)凍融敏感）。

5. 加完所有試劑后用槍頭吹打幾次或稍微渦旋或輕彈管壁以保證充分混勻。

6. 使用陰性對照檢查污染的發(fā)生。

7. 使用陽性對照（能良好擴(kuò)增的樣本）。

8. 電泳時使用DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品（指示是否PCR失敗或條帶跑出凝膠或拍照系統(tǒng)失?。?。

9. 當(dāng)擴(kuò)增很長的、GC含量高的模板時或容易產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)的模板時適量使用添加劑（glycerol, formamide, NMP使變性和退火溫度降低幾度；glycerol也可起到穩(wěn)定聚合酶活性的作用；DMSO 減少二級結(jié)構(gòu)的發(fā)生，并通過減弱非特異性引物結(jié)合的穩(wěn)定性，提高反應(yīng)的特異性）。

10. 不使用帶有自動除霜功能的冰箱存儲酶（避免反復(fù)凍融），每次取酶時都使用新的槍頭酶，酶使用后應(yīng)立即放回冰箱。酶要在加完緩沖液后再加，直接將酶加入水中可能導(dǎo)致酶變性失活。

11. PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間，一般為48 h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。

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