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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)操作步驟

時間:2024/8/5閱讀:440
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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法,為常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一。操作步驟:
1.在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer 5 μl
dNTP mix (2mM) 4 μl
  引物1(10pM) 2 μl
 引物2(10pM) 2 μl
Taq酶 (2U/μl) 1 μl
DNA模板(50ng-1μg/μl)  1 μl
加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。
2. 調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執(zhí)行擴(kuò)增。一般:在93℃預(yù)變性3-5min,進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環(huán)30-35次,最后在72℃ 保溫7min。
3. 結(jié)束反應(yīng),PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4.PCR的電泳檢測:如在反應(yīng)管中加有石蠟油,需用100μl氯仿進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測。

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