限制性內切酶的主要功能是保護細菌不受噬菌體的感染，這一觀點已被人們廣泛接受。它們作為微生物免疫機制的一部分行使其功能。當一個沒有限制性內切酶的細菌被病毒感染時，大部分病毒顆粒都能成功地進行感染。然而一個有限制性內切酶的同種細菌被成功感染的比率顯著下降。出現更多的限制性內切酶將會起到多重保護作用;而一個擁有4到5種各自獨立的限制性內切酶將會使細胞堅不可摧。

限制性內切酶常常伴隨一到兩種修飾酶（甲基化酶）出現。后者的作用是保護細胞自身的DNA不被限制性內切酶破壞。修飾酶識別的位點與相應的限制性內切酶相同，但只甲基化每條鏈中的一個堿基，而不是切開DNA鏈。限制性內切酶識別位點處的甲基基團伸入到雙螺旋的大溝中去，阻礙了限制性內切酶的作用。這樣，限制性內切酶和它的"搭檔"--甲基化酶一起就構成了限制-修飾（R-M）系統。在一些R-M系統中，限制性內切酶和修飾酶是兩種不同的蛋白，它們各自獨立行使自己的功能;而在另一些系統中，兩種功能由同一種限制-修飾酶的不同亞基，或是同一亞基的不同結構域來執行。

傳統上將限制性內切酶按照亞基組成、酶切位置、識別位點、輔助因子等因素劃分為三大類。然而，蛋白測序的結果表明，限制性內切酶的變化多種多樣，若從分子水平上分類，則應當遠遠不止這三種。

I型限制性內切酶是一類兼有限制性內切酶和修飾酶活性的多個亞基的蛋白復合體。它們在識別位點很遠的地方任意切割DNA鏈。以前人們認為I型限制性內切酶很稀有，但現在通過對基因組測序的結果發現這一類酶其實很常見;盡管I型酶在生化研究中很有意義，但由于不產生確定的限制片段和明確的跑膠條帶，因而不具備實用性。

II型酶在其識別位點之中或臨近的確定位點特異地切開DNA鏈。它們產生確定的限制片段和跑膠條帶，因此是三類限制性內切酶中*用于DNA分析和克隆的一類。II型限制性內切酶由一群性狀和來源都不盡相同的蛋白組成，因而任意一種限制性內切酶的氨基酸序列可能與另一種限制性內切酶的氨基酸序列截然不同。實際上，從已知的情況上看，這些酶很可能是在進化過程中各自獨立產生的，而非來源于同一個祖先。

II型限制性內切酶中zui普遍的是象Hha I、Hind III和Not I這樣在識別序列中進行切割的酶。這一類酶是構成商業化酶的主要部分。大部分這類酶都以同二聚體的形式結合到DNA上，因而識別的是對稱序列;但有極少的酶作為單聚體結合到DNA上，識別非對稱序列。一些酶識別連續的序列（如EcoR I識別GAATTC）;而另一些識別不連續的序列（如Bgl I識別GCCNNNNNGGC）。限制性內切酶的切割后產生一個3"羥基端和一個5"磷酸基團。它們的活性要求鎂離子，而相應的修飾酶則需要S-甲硫氨酸腺苷的存在。這些酶一般都比較小，亞基一般都在200-300個氨基酸左右。

另一種比較常見的酶是所謂的IIS型酶，比如Fok I和Alw I，它們在識別位點之外切開DNA。這些酶的大小居中，約為400-650個氨基酸左右;它們識別連續的非對稱序列，有一個結合識別位點的域和一個專門切割DNA的功能域。一般認為這些酶主要以單體的形式結合到DNA上，但與臨近的酶結合成二聚體，協同切開DNA鏈。因此一些IIS型的酶在切割有多個識別位點的DNA分子時，活性可能更高。

第三種II型限制性內切酶（有時也被稱為IV型限制性內切酶）是一類較大的、集限制和修飾功能于一體的酶，通常由850-1250個堿基組成，在同一條多肽鏈上同時具有限制和修飾酶活性。有些酶識別連續序列，并在識別位點的一端切開DNA鏈;而另一些酶識別不連續的序列（如Bcg I：CGANNNNNNTGC），并在識別位點的兩端切開DNA鏈，產生一小段含識別序列的片段。這些酶的氨基酸序列各不相同，但其結構組成是一致的。他們在N端由一個負責切開DNA的功能域，這個域又與DNA修飾域連接;此外還有一到兩個識別特異DNA序列的功能域構成C端，或以獨立的亞基形式存在。當這些酶與底物結合時，它們或行使限制性內切酶的功能切開底物，或作為修飾酶將其甲基化。

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