ELISA試劑盒實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫，試劑不能直接在37 溶解；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應預測樣品含量，如樣品濃度過高時，應對樣品進行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應的稀釋倍數。
1、 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液 100  ，余孔分別加標準品或待測樣品100 ，注意不要有氣泡，加樣 時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37 溫育2小時。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2、 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100 （臨用前配制），酶標板加上覆膜，37 溫育1小時。
3、 棄去孔內液體，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400 /每孔，甩干（也可輕拍將孔內液體拍干）。 
4、 每孔加檢測溶液B工作液（臨用前配制）100 ，加上覆膜，37 溫育1小時。
5、 棄去孔內液體，甩干，洗板5次，方法同步驟3。
6、 每孔加底物溶液90 ，酶標板加上覆膜37 避光顯色（反應時間控制在15-30分鐘，當標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯時，即可終止）。
7、 每孔加終止溶液50 ，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。
8、 立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度（OD值）。

ELISA試劑盒注：
1、 試劑準備：所有試劑在使用前應平衡至室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。
2、 加樣：加樣或加試劑時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的 “預溫育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。一次加樣時間（包括標準品及所有樣品）控制在10分鐘內。*設置復孔進行實驗。
3、 溫育：為防止樣品蒸發，實驗時將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內，以避免液體蒸發；洗板后應盡快進行下步操作，任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態；同時應嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。
4、 洗滌：洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶標儀讀數。
5、 試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據所需的量配制使用，并使用相應的稀釋液配制，不能混淆。請 配制標準品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10 ），以避免由于不準確稀  釋而造成濃度誤差；請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液。
6、 反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘），如顏色較深，請提前加入終止液終止反應，避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數。
7、 底物：底物請避光保存，在ELISA試劑盒儲存和溫育時避免強光直接照射。