有多種不同的方法可使抗原有效地結(jié)合到免疫親和柱上。因?yàn)榭贵w是通過共價(jià)與微珠偶聯(lián)，而不是在溶液中，抗體—微珠／抗原作用完成所需的時(shí)間比抗體和抗原二者以游離狀態(tài)在溶液中所需的時(shí)間要長得多。因此，采用的方法應(yīng)使抗原交連的抗體達(dá)到大程度的結(jié)合。推薦使用兩種結(jié)合方法：將抗原溶液加入呈糊狀的抗體—微珠內(nèi)不斷混和均勻；或?qū)⒖乖芤毫鹘?jīng)抗體—微珠層析柱，保持抗原與抗體盡可能長時(shí)間的接觸。如沒有別的問題，應(yīng)首先選擇在抗體—微珠柱內(nèi)結(jié)合。若是結(jié)果不夠理想，可以試用在溶液中結(jié)合的方法。先用幾支小型層析柱測試佳結(jié)合和收集抗原的條件。

1．親和力
雖然抗體對抗原的親和力可以計(jì)算，但對大多數(shù)工作來說，決定性的標(biāo)準(zhǔn)是抗體是否可以將抗原從溶液中定量地分離出來。簡單的方法是建立一個(gè)小規(guī)模的反應(yīng)，測試初洗滌液中抗原的含量。如果抗體—微珠基質(zhì)在l一2h內(nèi)不能分離大多數(shù)抗原，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)做一些變動(dòng)，可能會(huì)有些幫助。使微珠上偶聯(lián)較多的抗體或增加微珠的用量抑或延長結(jié)合時(shí)間，可以使結(jié)合的抗原量增加。但這些條件會(huì)增加非特異性本底，所以一般應(yīng)綜合考慮獲得高產(chǎn)量和低本底的條件，另一方面，使用高親和力的抗體可以解決有效收集抗原的問題。其次使用稀釋的溶液，相對較低的濃度和較短的結(jié)合時(shí)間，這些條件都可使本底降低。

2．滴定
作為測定的*個(gè)步驟，先確定所需柱基質(zhì)與結(jié)合給定量抗原的比值。方法與免疫沉淀法相同。將等體積的抗體—微珠基質(zhì)加到含不同濃度抗原的樣本中，糊狀物在4C混合1h，以后過程同標(biāo)準(zhǔn)免疫沉淀試驗(yàn)。這樣就可以得出關(guān)于收集所需抗原必要的分離柱基質(zhì)體積的估計(jì)量。如果從結(jié)合反應(yīng)的上清液中測得抗原，也可以測定被除去的無關(guān)抗原量。

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