1.1定義:分光光度法是利用物質(zhì)所*的吸收光譜來鑒別物質(zhì)或測定其含量的分析檢測技術(shù).
　　
　　1.2特點(diǎn):靈敏,,快速和簡便,在復(fù)雜組分系統(tǒng)中,不需要分離,即能檢測出其中所含的極少量物質(zhì).
　　
　　1.3應(yīng)用:生物<>化學(xué)研究中廣泛使用的方法之一,廣泛用于糖,蛋白質(zhì),核酸,酶等的快速定量檢測.
　　
　　2.分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)和工作原理
　　
　　2.1分光光度計(jì)的分類
　　
　　紅外分光光度計(jì):測定波長范圍為大于760nm的
　　
　　紅外光區(qū)可見光分光光度計(jì):測定波長范圍為400~760nm的
　　
　　可見光區(qū)紫外分光光度計(jì):測定波長范圍為200～400nm的紫外光區(qū)
　　
　　2.2分光光度計(jì)工作原理人眼可見的光只占電磁波譜的很小—部分（400~760nm）它是一種頻率較大的電磁波.電磁波按頻率大小,從頻率Z小的無線電波到頻率Z大的γ-射線排成一列,即組成電磁波的波譜
　　
　　2.2.1分光光度計(jì)的光譜范圍包括波長范圍為400~760nm的可見光區(qū)和波長范圍為200～400nm的紫外光區(qū).不同的光源都有其*的發(fā)射光譜,因此可采用不同的發(fā)光體作為儀器的光源.鎢燈的發(fā)射光譜:鎢燈光源所發(fā)出的400～760nm波長的光譜,光通過三棱鏡折射后,可得到由紅,橙,黃,綠,藍(lán),靛,紫組成的連續(xù)色譜;該色譜可作為可見光分光光度計(jì)的光源.氫燈的發(fā)射光譜:氫燈能發(fā)出185～400nm波長的光譜,可作為紫外光光度計(jì)的光源.
　　
　　2.2.2物質(zhì)的吸收光譜
　　
　?。?）如果在光源和棱鏡之間放上某種物質(zhì)的溶液,此時(shí)在屏上所顯示的光譜已不再是光源的光譜,它出現(xiàn)了幾條暗線,即光源發(fā)射光譜中某些波長的光因溶液吸收而消失,這種被溶液吸收后的光譜稱為該溶液的吸收光譜.不同物質(zhì)的吸收光譜是不同的.因此根據(jù)吸收光譜,可以鑒別溶液中所含的物質(zhì).
　　
　?。?）當(dāng)光線通過某種物質(zhì)的溶液時(shí),透過的光的強(qiáng)度減弱.因?yàn)橛幸徊糠止庠谌芤旱谋砻娣瓷浠蚍稚?一部分光被組成此溶液的物質(zhì)所吸收,只有一部分光可透過溶液.入射光=反射光+分散光+吸收光+透過光如果我們用蒸餾水（或組成此溶液的溶劑）作為"空白"去校正反射,分散等因素造成的入射光的損失,則:入射光=吸收光十透過光
　　
　　2.2.3物質(zhì)吸光度（A）與透射比（T）的關(guān)系設(shè)I0為經(jīng)過空白校正后入射光的強(qiáng)度;I為透過光的強(qiáng)度.根據(jù)實(shí)驗(yàn)得知I=I0?10-εcl式中,c表示吸收物質(zhì)的摩爾濃度;l表示吸收物質(zhì)的光徑,用cm表示;ε表示吸收物質(zhì)的摩爾消光系數(shù),它表示物質(zhì)對光的吸收特性,不同物質(zhì)的ε數(shù)值不同.所以I/I0=10-εcl令T（透射比）=I/I0T=10-εcl若以T對吸收物質(zhì)的濃度作圖,則得圖1-5-2中的曲線.由上式可得1g（1/T）=εcllg（l/T）為物質(zhì)的吸光度（A）A=1g（1/T）2.2.4Lambert-Beer定律（E=εcl）上式說明了物質(zhì)的吸光度與吸收物質(zhì)的濃度和液層的厚度成正比,這就是光吸收的基本定律--Lambert-Beer（朗伯-比耳）定律.
　　
　　2.3分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)
　　
　　無論哪一類分光光度計(jì)都包括:光源,單色器,吸收池,檢測器和測量儀表，幾個(gè)基本部件介紹如下：
　　
　?。?）:光源:分光光度計(jì)上常用的光源有兩種:鎢絲燈或氫燈,在可見光區(qū),近紫外光區(qū)和近紅外光區(qū)常用鎢絲燈作為光源;在紫外光區(qū)多使用氫弧燈.單色器:把混合光波分解為單—波長光的裝置.在分光光度計(jì)中多用作為色散元件.吸收池比色杯,比色皿,比色池）一般由玻璃,石英或熔凝石英制成,用來盛被測的溶液.在低于350nm的紫外光區(qū)工作時(shí),必須采用石英池或熔凝石英池.分光光度計(jì)的基本部件
　　
　　（2）:吸收池（比色皿）必須與光束方向垂直.此外,每套比色皿的質(zhì)料,厚度應(yīng)*相同,以免產(chǎn)生誤差.比色皿上的指紋,油污或壁上的沉積物都會(huì)顯著地影響其透光性,因此在使用前務(wù)必*清洗.常用光電池,光電管和光電倍增管三種.測量裝置—般常用的紫外光和可見光分光光度計(jì)有3種測量裝置,即電流表,記錄器和數(shù)字示值讀數(shù)單元.現(xiàn)代的儀器常附有自動(dòng)記錄器,可自動(dòng)描出吸收曲線.檢測器棱鏡與光柵棱鏡:光波通過棱鏡時(shí),不同波長的光折射率不同;因而能將不同波長的光分開.玻璃對紫外線的吸收力強(qiáng),故玻璃棱鏡多用于可見光分光光度計(jì).石英棱鏡可在整個(gè)紫外光區(qū)傳播光,故在紫外光分光光度計(jì)中廣為應(yīng)用.衍射光柵:在石英或玻璃表面上刻劃許多平行線（每英寸約刻15000—30000條）.由于刻線處不透光,通過光的干涉和衍射使較長的光波偏折角度大,較短的光波偏折角度小,因而形成光譜.棱鏡單色器裝置示意圖光源照到棱鏡（或光柵）以前,先要經(jīng)過一個(gè)入射狹縫,再通過平行光鏡使成為平行光束投到棱鏡上.透過棱鏡的光再經(jīng)另一聚光鏡,在此聚光鏡的焦面內(nèi)可得一清楚的光譜圖.如在焦線處放—出射狹縫,轉(zhuǎn)動(dòng)棱鏡使光譜移動(dòng),就可以從出射狹縫射出所需要的單色光.整個(gè)裝置稱為"單色器"檢測器---光電池光電池裝在一個(gè)特制的匣子里面由3層物質(zhì)組成的圓形或長方形薄片.*層是一種導(dǎo)電性良好的金屬,這是光電池的負(fù)極.中間極薄的一層是半導(dǎo)體硒,第3層是鐵,這是光電池的正極.當(dāng)光電池受光照射以后,半導(dǎo)體硒的表面逸出電子,這些電子只向負(fù)極方向移動(dòng),而不向正極移動(dòng),因此在上下兩金屬片間產(chǎn)生一個(gè)電位差,線路連通時(shí)即產(chǎn)生電流。檢測器---光電管光電管光電管是由封裝在真空透明封套里的一個(gè)半圓柱型陰極和一個(gè)絲陽極組成.陰極的凹畫上有一層光電發(fā)射材料,此種物質(zhì)經(jīng)光照射可發(fā)射電子.當(dāng)在兩極間加有電位時(shí),發(fā)射出來的電子就流向絲陽極而產(chǎn)生光電流.對于相同的輻射強(qiáng)度,它所產(chǎn)生的電流約為光電池所產(chǎn)生電流的1/4.由于光電管具有很高的電阻,所以產(chǎn)生的電流容易放大.檢測器---光電倍增管光電倍增管它比普通的光電管*,它可將*次發(fā)射出的電子數(shù)目放大到數(shù)百萬倍.當(dāng)電子打在兼性陽極上時(shí),能引起更多的電子自表面射出.這些射出的電子又被第二個(gè)兼性陽極所吸引,同樣再產(chǎn)生更多的電子.此過程重復(fù)9次后,每個(gè)光子可形成106~107個(gè)電子.這些電子Z后被收集在陽極上.所得到的倍增電流可進(jìn)一步加以放大和測量.
　　
　　2.4分光光度法的測量誤差
　　
　　選擇適宜波長的入射光控制吸光度A的遍數(shù)范圍選擇適當(dāng)?shù)膮⒈热芤簝x器測量誤差測量條件選擇
　　
　　2.4.1儀器測量誤差由朗伯-比爾定律可知,只有在一定的濃度范圍內(nèi),即一定的吸光度范圍同內(nèi),由分光光度計(jì)測量所引起的測定結(jié)果的相對誤差才是較小的;當(dāng)透光率接近0或1.0時(shí),其相對誤差趨于無限大;一般在百分透光率在10~80%的范圍內(nèi)（即吸光度在1~0.1）,濃度測量相對誤差較小;對于精密度高的儀器.當(dāng)吸度A=0.7-0.2時(shí)（百分透光率約為20-60%,測量誤差約為1%.
　　
　　2.4.2測量條件選擇
　　
　?。?）選擇適宜波長的入射光:由于有色物質(zhì)對光有選擇性吸收,為了使測定結(jié)果有較高的靈敏度,必須選擇溶液Z大吸收波長的入射光.
　　
　?。?）控制吸光度A的準(zhǔn)確的讀數(shù)范圍:由朗伯-比耳定律可知,吸光度只有控制在0.2~0.7讀數(shù)范圍內(nèi)時(shí),測量的準(zhǔn)確度較高.
　　
　?。?）選擇參比溶液:參比溶液是用來調(diào)節(jié)儀器工作零點(diǎn)的.若樣品溶液,試劑,顯色劑無無色可用蒸餾水作參比溶液;反之應(yīng)采用不加顯色劑的樣品液作參比溶液