【儀表網 儀表研發】日本東京大學研究人員開發了一種方法，可以提高現有定量相位成像的靈敏度，同時看到活細胞內從微小顆粒到大型結構的所有結構。
2021年伊始，顯微鏡技術也迎來新的跨越。
光物理學家開發出一種新方法，利用現有顯微鏡技術，無需添加染色劑或熒光染料，就能更詳細地觀察活細胞內部。
一種熒光壽命顯微鏡技術，能夠使用頻率梳而不是機械部件來觀察動態生物現象。
“我認為無標簽技術將是一個重要的研究方向。特別是以無標簽的方式對細胞內外病毒和外來體等小顆粒進行測量的技術將是未來成像設備的一個趨勢。”其中一項研究的領導者、日本東京大學光子科學與技術研究所副教授Takuro Ideguchi在接受《中國科學報》采訪時表示。
更大范圍 更小相位變化
由于單個細胞幾乎是半透明的，因此顯微鏡照相機必須能探測到穿過部分細胞的光線的極其細微的差異。這些差異被稱為光的相位。相機圖像傳感器則受到它們能檢測到的光相位差的限制，即動態范圍。
“為了使用同一圖像傳感器看到更詳細的信息，我們必須擴大動態范圍，這樣就可以探測到更小的光相位變化。”Ideguchi說，“更大的動態范圍允許我們測量小型和大型的相位圖像。例如，如果測量一個細胞，細胞的主干會產生大的相位變化，而細胞內的小顆粒/分子會產生小的相位變化。為了使兩者可視化，我們必須擴大測量的動態范圍。”
該研究小組開發了一種技術，通過兩次曝光分別測量光相位的大小變化，然后將它們無縫連接起來，制造出詳細的終圖像。他們將這種方法命名為自適應動態范圍偏移定量相位成像(ADRIFT-QPI)。相關論文近日發表于《光：科學與應用》。
一直以來，定量相位成像是觀察單個細胞的有力工具，它允許研究人員進行詳細的測量，比如根據光波的位移跟蹤細胞的生長速度。然而，由于圖像傳感器的飽和容量較低，該方法無法跟蹤細胞內及周圍的納米顆粒。
而新方法克服了定量相位成像的動態范圍限制。在ADRIFT-QPI中，相機需要兩次曝光，并產生一個終圖像，其靈敏度是傳統定量相顯微鏡的7倍。
兩次曝光 告別光毒
第一次曝光是用常規的定量相位成像產生的——平的光脈沖指向樣品，并在它通過樣品后測量光的相移。計算機圖像分析程序基于第一次曝光的圖像，快速設計一個反射樣品圖像。然后，研究人員用一個叫做波前整形裝置的獨立組件，用更高強度的光產生一種“光雕塑”，以獲得更強的照明，并向樣品發出脈沖，進行第二次曝光。
如果第一次曝光產生的圖像是樣品的代表，第二次曝光的雕刻光波將以不同的相位進入并穿過樣品，終只能看到一個黑暗的圖像。
“有趣的是，我們在某種程度上抹去了樣本的圖像。實際上，我們幾乎什么都不想看到。我們去掉了大的結構，這樣就能看到小的細節。”Ideguchi解釋道，由于第一次測量中存在較大的相位對象，受動態范圍的限制，無法對較小的相位對象進行可視化，研究人員稱之為“洗掉”。他們需要第二次測量觀察動態范圍移位的小相位物體的細節。
此外，該方法不需要特殊的激光、顯微鏡或圖像傳感器，研究人員可以使用活細胞，而且不需要任何染色或熒光，出現光毒性的可能性很小。光毒性是指用光殺死細胞，這也是其他成像技術如熒光成像面臨的一個問題。
另一篇論文的通訊作者、日本德島大學Post-LED光子學研究所教授Takeshi Yasui指出，在傳統的激光掃描共焦顯微鏡中，強激發光聚焦在一個焦點上，并對焦點進行二維機械掃描，使光毒性的影響較強。 Yasui等人的熒光成像新方法中，激發光被聚焦為一個二維焦點，因此每個焦點的光強度變得非常弱。“光毒性高度依賴于入射光的強度，我們的方法也可以顯著降低。”
改造熒光成像
實際上，熒光顯微鏡廣泛用于生物化學和生命科學，因為它允許科學家直接觀察細胞及其內部和周圍的某些化合物。熒光分子能吸收特定波長范圍內的光，然后在較長的波長范圍內重新發射。
然而，傳統熒光顯微技術的主要局限性是其結果難以定量評價，而且熒光強度受實驗條件和熒光物質濃度的顯著影響。現在，一項新研究將徹底改變熒光顯微鏡領域。
當熒光物質被一束短脈沖光照射時，產生的熒光不會立即消失，而是隨著時間的推移“衰減”。但熒光衰減非常快，普通相機無法捕捉到它。雖然可以使用單點光電探測器，但必須在整個樣本區域進行掃描，才能從每個測量點重建出完整的二維圖像。這個過程涉及到機械部件的運動，這極大限制了圖像捕捉的速度。
幸運的是，在近發表于《科學進展》的一項研究中，科學家開發了一種不需要機械掃描就能獲得熒光壽命圖像的新方法。領導這項研究的日本德島大學Post-LED光子學研究所教授Takeshi Yasui說，“我們能在2D空間上同時映射44400個‘光秒表’來測量熒光壽命——所有這些都在一次拍攝中，不需要掃描。”
“到目前為止，光頻率梳被廣泛地用作測量光頻率的標尺，但我們一直在考慮其他的用途。”Yasui在接受《中國科學報》采訪時說，“我們意識到，如果將光學頻率梳視為具有超離散多光譜結構的光，通過維數轉換將被測物理量疊加在光譜上，可以從雙梳光譜獲得的模式分辨光譜中共同獲得被測物理量。”
研究人員使用光學頻率梳作為樣品的激發光。一個光學頻率梳本質上是一個光信號，它們之間的間隔是恒定的。研究人員將一對激發頻率梳信號分解為具有不同強度調制頻率的單個光拍信號(雙梳光拍)，每個光拍攜帶單個調制頻率，輻照到目標樣品上。而且，每束光束都在一個不同的空間位置擊中樣本，在樣本二維表面的每個點和雙梳光拍的每個調制頻率之間形成一一對應的關系。
研究人員用數學方法將測量信號轉換為頻域信號，根據調制頻率處的激發信號與測量信號之間存在的相位延遲，計算出每個像素處的熒光壽命。
Yasui表示，這將有助于動態觀察活細胞，還可以用于多個樣本的同時成像和抗原檢測——這種方法已經被用于疫情的診斷。該技術還有助于開發出新的頑固性疾病療法，提高預期壽命。
同樣，Ideguchi也提到，ADRIFT-QPI能夠在整個活細胞的背景下看到微小顆粒，而不需要任何標簽或染色。“該技術可以檢測到來自納米級粒子的細小信號，比如病毒或在細胞內外移動的粒子，這樣就可以同時觀察它們的行為和細胞的狀態。”
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