【儀表網(wǎng) 研發(fā)快訊】生物大分子的三維結(jié)構(gòu)可以直觀地揭示其生物學(xué)功能、細胞內(nèi)進程以及探索其在疾病中發(fā)揮作用的方式。冷凍電鏡(cryo-electron microscopy,cryo-EM)單顆粒分析技術(shù)通過對生物大分子的直接成像進行高分辨率結(jié)構(gòu)測定，已成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)的重要研究手段。冷凍電鏡單顆粒分析技術(shù)需要對生物大分子溶液的冷凍樣品采集大量電子顯微數(shù)據(jù)，以進行三維結(jié)構(gòu)解析，因此高質(zhì)量的冷凍樣品制備在其中起著至關(guān)重要的作用。良好的制樣方法需要能夠簡便地、可控地制備出接近理想狀態(tài)的生物大分子冷凍樣品。
 

　　諾貝爾化學(xué)獎獲得者雅克·杜博切特(Jacques Dubochet)等人于1984年發(fā)明了冷凍樣品制備的濾紙夾置法(Pipet-blot-plunge)，至今仍然是冷凍電鏡樣品制備的主要手段。在這種傳統(tǒng)的制樣方法中，研究人員難以精確控制樣品冰層厚度和大分子顆粒分布，導(dǎo)致冷凍樣品的均一性和可重復(fù)性較差。越來越多的證據(jù)表明，在樣品被冷凍之前的瞬間，生物大分子會吸附在超薄的液體層的氣液界面(Air-water interface, AWI)上，導(dǎo)致生物大分子的顆粒結(jié)構(gòu)損傷、變性或產(chǎn)生優(yōu)勢取向，減低了高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)分析的效率和成功性。如何獲取可重復(fù)的高質(zhì)量的生物大分子冷凍樣品仍然是冷凍電鏡技術(shù)應(yīng)用中的一個難題。
 

圖1. ESI-cryoPrep方法設(shè)計和儀器裝置示意圖
 

　　4月25日，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王宏偉課題組和精密儀器系歐陽證、周曉煜課題組在《自然·方法學(xué)》(Nature Methods)在線發(fā)表了題為“電噴霧輔助的冷凍電鏡樣品制備方法用以減輕界面吸附效應(yīng)”(Electrospray-assisted cryo-EM sample preparation to mitigate interfacial effects)的研究論文。研究采用非變性質(zhì)譜(Native mass spectrometry, native MS)中廣泛使用的電噴霧電離(Electrospray ionization, ESI)技術(shù)，設(shè)計并搭建了一種新型冷凍樣品制備裝置ESI-cryoPrep(圖1)，成功實現(xiàn)了無需濾紙夾吸的冷凍樣品制備，并獲得了多種生物大分子近原子分辨率的三維結(jié)構(gòu)。
 

　　研究表明，ESI-cryoPrep可以有效地將生物大分子顆粒完整嵌入無定形態(tài)薄層冰中，避免其吸附在空氣-水、固體-水界面上，并對該裝置制備生物大分子冷凍樣品過程中的界面模型進行了機理闡釋。ESI-cryoPrep以“軟”電離技術(shù)ESI為基礎(chǔ)，通過向蛋白溶液施加高電壓形成大量帶電的蛋白液滴，可以有效地減少蛋白的變性與碎裂。在電場的驅(qū)動下，帶電液滴飛向電鏡載網(wǎng)的過程中伴隨著去溶劑化的進行；液滴表面的電荷密度激增至瑞利極限導(dǎo)致庫侖裂變形成帶電的次級液滴；這一過程循環(huán)往復(fù)直至液滴最終沉積在電鏡載網(wǎng)上；收集到帶電液滴的電鏡載網(wǎng)被插入液氮冷卻的液態(tài)乙烷中即可實現(xiàn)對液滴的快速冷凍。該過程完全省卻了濾紙的夾吸，避免了濾紙材料對液體和生物大分子的影響。因為液滴表面的小分子離子形成了雙電層效應(yīng)，生物大分子與液體的界面被隔絕開，從而避免了生物大分子吸附到氣液或固液界面上，更好地保持了生物大分子的天然結(jié)構(gòu)。該研究首次對ESI液滴中的生物大分子的天然結(jié)構(gòu)(Native structures)進行了直接測定，指導(dǎo)獲得ESI的“軟著陸”電離參數(shù)進行冷凍制樣與非變性質(zhì)譜分析。該工作是冷凍電鏡與質(zhì)譜技術(shù)的交叉融合，共同致力于解答生物大分子結(jié)構(gòu)解析與分析的科學(xué)問題。
 

　　研究團隊在搭建的設(shè)備上，經(jīng)過多次摸索確定了制備高質(zhì)量冷凍樣品的相關(guān)參數(shù)。這些參數(shù)既能滿足保存高比例完整結(jié)構(gòu)生物大分子顆粒的需求，又能促進帶電液滴在附著電鏡載網(wǎng)表面的擴展和浸潤。研究團隊運用優(yōu)化的ESI-cryoPrep裝置制備了五種生物大分子的高質(zhì)量冷凍樣品，獲得了與目標生物大分子尺寸相對應(yīng)的理想冰層厚度，并實現(xiàn)了全部測試樣品70Sribosome、20Sproteasome、apo-ferritin、ACE2和streptavidin的高分辨率三維結(jié)構(gòu)解析，分辨率分別為2.7Å、2.0Å、2.1Å、3.3Å和1.9Å。
 

　　研究團隊對冷凍電鏡數(shù)據(jù)進行了深入的挖掘與分析，發(fā)現(xiàn)與預(yù)期假設(shè)一致的結(jié)果。ESI-cryoPrep可以有效地將生物大分子顆粒完整嵌入無定形態(tài)冰的薄層中間，抑制目標生物大分子在空氣-水或石墨烯-水界面的吸附(圖2)，從而避免蛋白質(zhì)顆粒的結(jié)構(gòu)損傷或者優(yōu)勢取向問題。研究工作提出了電荷殘留模型，闡明了電噴霧電離產(chǎn)生的液滴表面的電荷不均勻分布保護蛋白質(zhì)顆粒免于界面吸附的作用和機制。這種學(xué)科交叉的研究成果不僅將為冷凍電鏡樣品制備提供應(yīng)用價值，還將對冷凍電鏡技術(shù)和非變性質(zhì)譜領(lǐng)域的交叉和發(fā)展產(chǎn)生積極影響，為更多創(chuàng)新應(yīng)用開辟新的可能性。自主研發(fā)的高質(zhì)量冷凍電鏡樣品制備裝置，一方面可以縮短結(jié)構(gòu)解析的漫長探索過程，更高效地獲得高分辨三維結(jié)構(gòu)，分析其作用機理；另一方面也提升了原創(chuàng)研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)和高精尖技術(shù)的能力，減少對國外相關(guān)儀器和設(shè)備的依賴。
 

　　圖2.ESI-cryoPrep方法制備的冷凍樣品中蛋白質(zhì)顆粒在斷層成像中的代表性空間分布

 

　　清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2017級博士生楊梓和精密儀器系2018級博士生范菁津(已畢業(yè))為該論文共同第一作者，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教授王宏偉，精密儀器系教授歐陽證和副教授周曉煜為論文共同通訊作者。清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王家副研究員和范瀟博士等為課題的啟動和推進作出重要貢獻。研究得到國家自然科學(xué)基金、騰訊基金會等的資助，并得到清華大學(xué)冷凍電鏡中心和計算中心的技術(shù)支持。