【儀表網(wǎng) 儀表標(biāo)準(zhǔn)】由中國材料與試驗標(biāo)準(zhǔn)化委員會科學(xué)試驗標(biāo)準(zhǔn)化領(lǐng)域委員會科學(xué)試驗創(chuàng)新方法標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(CSTM/FC98/TCO2)歸口承擔(dān)的《玉米褪綠斑駁病毒形態(tài)學(xué)檢測透射電子顯微鏡法》團體標(biāo)準(zhǔn)(立項號:CSTM LX 980200999—2022)已完成征求意見稿，按照《中關(guān)村材料試驗技術(shù)聯(lián)盟團體標(biāo)準(zhǔn)管理辦法》的有關(guān)規(guī)定，現(xiàn)公開廣泛征求意見。
 

　　玉米褪綠斑駁病毒(Maize chlorotic mottle virus, MCMV)是侵染玉米的重要檢疫性病毒病原，被列入《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》。該病毒與馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)的幾種病毒之一復(fù)合侵染引起的玉米致死壞死病(corn lethal necrosis，CLN)，是玉米生產(chǎn)的毀滅性病害，一旦發(fā)生將帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。MCMV為直徑30nm的二十面體對稱球狀粒子，可經(jīng)汁液、介體葉甲和薊馬傳播，田間擴散容易，在病毒分類學(xué)上歸屬于類番茄叢矮病毒目(Tolivirales)、番茄叢矮病毒科(Tombusviridae)、玉米褪綠斑駁病毒屬(Machlomovirus)(附錄A)。應(yīng)用透射電子顯微鏡可觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)以及細胞病理學(xué)特征，是驗證抗體檢測和分子檢測結(jié)果的重要形態(tài)學(xué)檢測依據(jù)。
 

　　透射電鏡為大型精密儀器，技術(shù)要求較高，用透射電鏡技術(shù)檢測植物病毒雖然廣泛應(yīng)用于高等院校、科研院所、檢驗檢疫機構(gòu)，但由于各個電鏡實驗室技術(shù)能力的差異，在具體操作上缺少統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，往往造成檢測結(jié)果差別很大。迄今為止還沒有一個國家或者行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)可用于規(guī)范MCMV的電鏡檢測分析，我們也沒有查到相應(yīng)的國際標(biāo)準(zhǔn)。因此，有必要先制定一部規(guī)范MCMV透射電鏡形態(tài)學(xué)檢測診斷的團體標(biāo)準(zhǔn)，把關(guān)鍵的樣品前處理程序以及電鏡判定標(biāo)準(zhǔn)確定下來，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和科學(xué)性。
 

　　本文件參照GB/T 1.1—2020 《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》，GB/T 20001.4《標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則 第4部分：試驗方法標(biāo)準(zhǔn)》給出的規(guī)則起草。參考SN/T 2964-2011 植物病毒檢測規(guī)范；SN/T 2122-2015 進出境植物及植物產(chǎn)品檢疫抽樣；GB/T 31810-2015 玉米褪綠斑駁病毒檢疫鑒定方法等規(guī)程編制。
 

　　本文件規(guī)定了應(yīng)用透射電子顯微鏡對玉米褪綠斑駁病毒進行形態(tài)學(xué)檢測的方法。本文件適用于玉米褪綠斑駁病毒的檢驗檢疫與鑒定。
 

　　方法原理：
 

　　負染色技術(shù)原理：采用高密度的重金屬鹽染色液(如磷鎢酸、醋酸雙氧鈾等)包圍低密度的樣品顆粒，使樣品顆粒周圍的電子密度得到增強，在透射電鏡下顯示暗背景襯托的淺色樣品顆粒形態(tài)及微細結(jié)構(gòu)，圖像呈現(xiàn)負反差。該方法直接對病毒懸液樣品進行負染色，操作簡便，可用于病毒快速檢測。
 

　　免疫電子顯微術(shù)原理：免疫電子顯微術(shù)分為免疫復(fù)合物電鏡技術(shù)和免疫標(biāo)記技術(shù)兩大類。免疫復(fù)合物電鏡技術(shù)是對電鏡載網(wǎng)上形成的抗原抗體免疫反應(yīng)復(fù)合物進行負染色后電鏡觀察，適用于病毒快速檢測診斷。免疫標(biāo)記技術(shù)是以抗體連接標(biāo)記物(如膠體金)作為探針，對細胞表面或細胞內(nèi)部的相應(yīng)抗原進行定位、定性及定量測定。
 

　　超薄切片技術(shù)原理：將經(jīng)過固定的生物樣品樣包埋在樹脂介質(zhì)中，采用超薄切片機將聚合的樣品包埋塊切成厚度為50 nm~100 nm的薄片，在透射電鏡下觀察細胞內(nèi)病毒分布及細胞病理變化。
 

　　儀器設(shè)備：
 

　　1.透射電子顯微鏡；2.超薄切片機；3.玻璃制刀機；4.超薄切片鉆石刀；5.高速離心機；6.正置光學(xué)顯微鏡；7.研缽；8.微型研磨器；9.渦旋振蕩儀；10.輝光放電儀；11.移液器(20μL、200μL)。
 

　　環(huán)境條件：
 

　　超薄切片機、透射電鏡應(yīng)安裝在獨立的房間內(nèi)，工作環(huán)境應(yīng)符合以下要求：a) 超薄切片機：相對濕度小于60%，溫度(20±5)℃，電源電壓(220±22)V，電源頻率(50±1)Hz，滿足防震要求。
 

　　b) 透射電鏡：相對濕度小于60%，溫度(20±5)℃，電源電壓(220±22)V，電源頻率(50±1)Hz，具備儀器專用地線，接地電阻值參照儀器說明書的要求。
 

　　試驗數(shù)據(jù)處理：
 

　　MCMV的透射電鏡形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果以圖像形式保存，病毒粒子形態(tài)與大小尺度符合附錄A和附錄C的特征數(shù)據(jù)。線粒體的囊泡化及纖維狀內(nèi)含物、過氧化物酶體外膜周邊小泡等細胞病理學(xué)特征為MCMV所特有，可作為形態(tài)學(xué)檢測診斷依據(jù)之一。
 

　　檢測結(jié)果發(fā)布：
 

　　檢測結(jié)果報告應(yīng)包括以下信息：a)檢測報告的唯一編號；b)樣品名稱；c)送樣人姓名、單位和地址；d)樣品的接收日期；e)檢測儀器及其工作條件；f)檢測結(jié)果和必要的說明；g)檢測人簽字；h)檢測報告負責(zé)人簽字；i)檢測報告的頁碼；j)發(fā)布檢測報告的實驗室名稱和地址；k)檢測報告的日期。
 

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