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  • RNA(熒光型)恒溫快速擴增試劑盒-Ⅱ

RNA(熒光型)恒溫快速擴增試劑盒-Ⅱ

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  • 所在地北京市
  • 更新時間2023-08-13
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RNA(熒光型)恒溫快速擴增試劑盒-Ⅱ 產品詳情

RNA(熒光型)恒溫快速擴增試劑盒-Ⅱ (貨號:WLRE8208KIT

原理概述:

本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴增技術:在常溫恒溫下,特殊修飾的反轉錄酶利用特異性引物DNA和模板RNA合成cDNA鏈,反應體系中的重組酶、單鏈DNA結合蛋白和DNA聚合酶以新合成的cDNA鏈為模板進行快速核酸擴增反應。本試劑盒在42 oC下,依賴核酸外切酶的作用,加入根據模版設計的特異的分子探針,使用熒光監測設備能實現對目標片段擴增過程的實時監控。適用于實驗室級別的RNA擴增以及其他檢測用途的RNA擴增使用。

產品特點:

本試劑盒具有靈敏度高、特異性強、反應時間短(僅需20 mins)等優點,反應組分為干粉狀態,操作簡便,易于保存。

可適用于各種品牌的熒光定量PCR儀,恒溫熒光擴增儀器等熒光檢測設備。

引物設計:

建議使用長度在 30-35 bp的引物,引物過短會影響擴增速度和檢測靈敏度;引物設計避免形成二級結構而影響擴增;擴增子長度建議在150-300 bp。

熒光探針設計:

探針序列不與特異性引物識別位點重疊,長度為46-52 nt,序列避免回文序列、內部二級結構和連續的重復堿基。探針共有四個修飾位點:距離5’端的≥35 nt的中部位置標記一個dSpacer(四氫呋喃,THF),作為核酸外切酶的識別位點;THF位點的上游標記一個熒光基團,下游標記一個粹滅基團,兩個基團的間距為2-4 nt;THF距離3’末端≥15 nt,并且3’末端標記一個修飾基團,例如胺基、磷酸基團或C3-Spacer。

試劑盒組成:

組成 含量
A buffer 1.6 mL×1管
B buffer 150 μL×1管
試劑 48份
使用說明書 1份

試劑盒儲存:

運輸條件:低溫運輸;

儲存條件:建議儲存溫度 ≤ -20 oC,避光保存,避免重壓和反復凍融;

產品有效期:14個月。

 

操作步驟:提前30分鐘將試劑盒所需組分取出,室溫融化,震蕩混勻。

1) 每個干粉反應管加入29.4 μL A buffer(注意:A buffer需融化混勻,否則會對實驗效果產生影響);

2) 每個反應管分別加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探針(引物和探針濃度為10 μM,對于多個反應、步驟1和步驟2可以混合后再分裝至反應管中);

3) 向反應管中依次加入11.5 μL ddH2O和2 μL核酸模板(可根據核酸濃度調整加入的核酸模板體積,并相應調整加入的ddH2O體積,至模板與ddH2O總體積為13.5 μL);

4) 最后向反應管中加入2.5 μL B buffer并充分混合(請務必上下顛倒甩動反應管8-10次進行混勻;對于多個反應,建議將B buffer加至反應管的蓋子內側上下顛倒后混勻);

5) 混勻后,將反應液甩(或快速離心)至管子底部,然后立即將反應管放入熒光檢測設備中。熒光檢測程序設置為:恒溫42 oC;每30 s采集一次FAM通道(信號采集通道的選擇與熒光探針設計一致)熒光值;反應時間20 mins。

注:如使用ABI系列PCR儀,請務必于passive referencequencher處均選擇“none”

體系配制

組分 體積(μL)
A buffer 29.4
上游引物(10 μM) 2
下游引物(10 μM) 2
探針(10 μM) 0.6
ddH2O和RNA模板 13.5
B buffer 2.5
總體積 50

注意事項:

1. 由于試劑盒靈敏度非常高,在進行反應時請注意避免核酸污染,并設置空白對照;

2. 使用時請取出實驗所需的MIRA反應單元的數量,剩余部分請置于存儲條件下。

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