組成及試劑配制:
1、酶標板:一塊(96孔)
2、 標準品(凍干品): 2瓶,請臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml,蓋好后室溫靜置大約10分鐘,同時反復顛倒/搓動以助溶解,其濃度為200 U/L,然后做系列倍比稀釋(注:不要直接在板中進行倍比稀釋),分別配制成200 U/L,100 U/L,50 U/L,25 U/L,12.5 U/L,6.25 U/L,3.12 U/L,樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品:取0.3ml (不要少于0.3ml )200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液:1×20ml。
4、 檢測稀釋液A:1×10ml。
5、 檢測稀釋液B:1×10ml。
服務流程:
公司產品僅用于科研接受訂單及樣品——RNA提取——RNA質量檢測——樣品cDNA合成——定量試驗——數據分析——結果交付——售后服務。
產品名稱 | 規格 | 貨號 |
NPTII基因檢測試劑盒(PCR-熒光探針法) | 48T 0.1PCR管 | YS-P014127 |
PCR反應鑒定——PCR反應條件:
循環步驟 | 溫度 | 時間 | 循環數 |
預變性 | 94℃ | 5 min | 1 |
變性 | 94℃ | 10 sec | 30-40 |
退火 | 50-65℃ | 20 sec | 30-40 |
延伸 | 72℃ | 30 sec/kb | 30-40 |
終延伸 | 72℃ | 5 min | 1 |
PCR反應的特異性決定因素為:
①引物與模板DNA特異正確的結合;
②堿基配對原則;
③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性;
④靶基因的特異性與保守性。
其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性,使反應中模板與引物的結合(復性)可以在較高的溫度下進行,結合的特異性大大增加,被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區,其特異性程度就更高。
(2) 靈敏度高
PCR產物的生成量是以指數方式增加的,能將皮克(pg=10-12g)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=10-6g)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞;在病毒的檢測中,PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位);在細菌學中zui小檢出率為3個細菌。
(3) 簡便、快速
PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶,一次性地將反應液加好后,即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應,一般在2~4 小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析,不一定要用同位素,無放射性污染、易推廣。
(4) 對標本的純度要求低
不需要分離病毒或細菌及培養細胞,DNA 粗制品及總RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活PCR技術概論。
反應五要素:
參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物:引物是PCR特異性反應的關鍵,PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。設計引物應遵循以下原則:
①引物長度: 15-30bp,常用為20bp左右。
②引物擴增跨度: 以200-500bp為宜,特定條件下可擴增長至10kb的片段。
③引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內部出現二級結構,避免兩條引物間互補,特別是3'端的互補,否則會形成引物二聚體,產生非特異的擴增條帶。
⑤引物3'端的堿基,特別是最末及倒數第二個堿基,應嚴格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點, 被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點, 這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性:引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。
引物量:每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol,以引物量產生所需要的結果為好,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會。
犬叢生蛋白(CLU)熒光素PE-Cy3標記兔IgG(流式同型對照)
犬干因子(SCF)(親和純化) 兔IgM
犬白介素1β(IL-1β)熒光素PE標記兔IgG(流式同型對照)
犬白介素12 p40(IL-12 p40)熒光素Cy5標記兔IgG(流式同型對照)
犬孕激素/孕酮(Pg)熒光素APC標記兔IgG(流式同型對照)
犬α干擾素(IFN-α) 鏈霉親和素標記兔抗人IgG
犬β干擾素(IFN-β)PE標記鏈霉親和素
犬白介素12(IL-12)堿性磷酸酶標記鏈霉親和素
犬狀腺素(T4)辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素
犬促狀腺素α亞(TSHA)金標記鏈霉親和素(10nm/15nm)
犬纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1)辣根過氧化物酶標記親合素
犬S100蛋白(S-100)辣根過氧化物酶標記兔抗HRP
犬胰島素(INS)辣根過氧化物酶標記兔抗人IgA
犬肌營養不良蛋白(DMD)辣根過氧化物酶標記的蛋白A
犬新蝶呤 (Neopterin) 辣根過氧化物酶標記牛血清白蛋白
犬D-二聚體(D2D) 辣根過氧化物酶標記人胰島素蛋白
NPTII基因檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)Glypican 4(Glypican proteoglycan 4) 磷脂酰蛋白聚糖-4抗原2-芐氧溴烷 97%
GRB2/ASH peptide 生長因子受體結合蛋白2抗原n-BOC-1,6-二氨己烷鹽酸鹽 97%
GZMB/CCPI(Granzyme B) 顆粒酶B抗原8-溴喹啉 97%
UTS2R/GPR14(Urotensin II receptor:G Protein Coupled Receptor 14) G蛋白偶聯受體14抗原2-(2-溴)四氫-2H-吡喃 96%
GPR30(G Protein Coupled Receptor 30) G蛋白偶聯受體30抗原對氟溴 98%
GnRHR peptide 促性腺激素釋放激素受體抗原正丁氯化鎂 2.0 M THF溶液
KiSS-1R/GPR54/GPCR54(KiSS-1 receptor/G-Protein Coupled Receptor 54) G蛋白偶聯受體54抗原叔丁氯化鎂 1.0 M in THF
GRK2/BARK1 (G-protein coupled receptor kinase 2) G蛋白偶合受體激酶2抗原叔丁氯化鎂 2.0 M 溶液